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惨了,因质粒用错,博士被撤稿,痛失学位,导师:我不允许各位重蹈覆辙.....

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质粒,小小的身体,大大的能量,对奋战在生物实验室的科研人而言是熟悉的伙伴。科学的车轮缓缓驶过,生化实验室不能失去质粒,正如西方不能失去耶路撒冷。

面对质粒,不少科研人心中五味杂陈,几家欢喜几家愁,质粒构建表达成功皆大欢喜,构建失败轻则耽误时间,重则影响毕业大计。

而有人则因构建质粒水平过于高超,读博多年归来,依然是替全课题组构建质粒的「工具人」,导师抓住一只羊使劲地薅羊毛,誓要让其发光发热到最后一分钟。


来源:小红书

质粒构建难题频出,犹如玄学

学霸君看完之后,既同情该网友的困境,又暗暗佩服其构建质粒百发百中的能力。毕竟,质粒构建与表达是分子生物学的技术难题,被质粒折磨得苦不堪言的人不在少数。

有人半夜辗转难眠,为质粒实验苦心孤诣,好不容易克服了酶切浓度不够、转化失败的困难,又面临 PCR 之后的条带暗淡无光的挑战。

每一步都严格按照师兄给的步骤严格执行,实验结果却颗粒无收。


来源:网络

每一个不长菌的培养皿,每一支废弃的离心管,见证了科研人在努力构建质粒时的茫然无措与心塞。


来源:图虫创意


来源:图虫创意

有人欲哭无泪,给别人构建重组质粒时百发百中,给自己构建质粒时,换了三个载体始终得不到想要的结果。幸运是有的,但不多,全部转移给他人了。


来源:网络

有人花费半年的时间构建一个简简单单的质粒,却始终敲不开成功的大门,就在最后一次打算放弃时,随便挑了三个菌落测序,意外地一次性成功。

踏破铁鞋无觅处,得来全不费工夫,不得不说这是一门玄学。


来源:网络

质粒构建和表达有绝招,细节必不可少

细节决定成败,质粒构建、转化、提取、鉴定、转染、测定一条龙过程结束,严格贯彻「细节为先」尤为重要,方能提高实验成功率。

首先,要熟悉目的质粒的构造和细节,做到有的放矢。世界上有无数种质粒, 天然存在的、人为改造的 …… 形态和功能数不胜数,让人眼花缭乱。

但质粒就像好比人,再复杂的「人」都由「鼻子+眼睛+嘴巴+耳朵」构成,换而言之,再复杂的质粒都由「起始位点+启动子+酶切位点+外源片段」等基本元件构成。

学霸君在此推荐以下方法让你先人一步掌握质粒细节:

1. 使用 Vector NTI 软件,里面含有大量常见和经典的质粒图谱,能够对质粒图谱了解更直观。

2. 查找质粒图谱的网站,能够对质粒的来源、构造和功能充分掌握。

Addgene 网址:http://www.addgene.org/


来源:Addgene

  • Vector DB 网址:http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector.html

  • NCBI 网址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

  • 欧洲分子生物学实验 EMBL:http://www.ebi.ac.uk/

其次,需要提醒的是,很多人的实验止步于提纯 DNA 这一步,使得前期工作付诸流水。通常,按得到质粒 DNA 的量可将质粒抽提方法和试剂盒分为小提,中提,大提。

做实验严丝合缝地按照步骤执行是严谨的体现,但是有时候也要在不违背主体原则下灵活地改变,例如,在提取质粒时,根据菌液量、实验目的等需要,灵活地选择合适的提取方案,才能获得浓度达标的 DNA,有效快速地推进实验。

毕竟,DNA 浓度直接关系到酶切、酶连、转化等一系列关键步骤,科研小伙伴不得不提起十二分精神。


来源:MCE 官网

此外,学霸君曾受转化步骤困扰,涂菌后的培养皿比脸还干净。经验丰富之后,才知道其中玄机满满。

  • 失败原因:转化后涂菌太少。

改进措施:将摇好的菌离心弃上清, 取沉淀的一半涂板,尤其是构建质粒时, 也可沉淀全部涂板。

  • 失败原因:转化后摇菌时间过短。

改进措施:适当增加摇菌时间,12-14 小时为佳。

  • 失败原因:感受态失效或错误使用。

改进措施:切勿反复冻融,切勿剧烈振荡。

  • 失败原因:抗生素加的比例过多或过少, 长出杂菌。

改进措施:细心认真地确认抗生素的添加是否正确,设置对照组。

东风借力,获得令人安心的质粒

质粒构建看似简单,实则每一步暗含玄机,稍有不慎,连累整个实验进程。之前有研究显示,近 50% 的实验室质粒存在明显的设计缺陷及序列错误。

东京医科牙科大学某博士因错误的质粒被撤销了博士学位,还有人因质粒使用不当被撤稿。这都是血泪教训!


来源:东京医科牙科大学官网,撤销博士学位声明

俗话说,他山之石,可以攻玉。除了自己努力构建质粒之外,学霸君在这里为大家推荐一个巧妙实用、事半功倍的方法,为方便迅捷地获得目的质粒保驾护航。

Addgene 是一个全球性的、非营利性的生物资源储存库,帮助科学家分享质粒的优质平台。它收藏了来自世界各地的 6109 个实验室的 146411 个质粒,其中包含 895 种即用型病毒载体和 214 种重组抗体。

重要的是,这些质粒被来自 111 个国家的科学家们充分利用,已经被请求使用 2128046 次。


来源:Addgene 官网

此外,该平台还提供质粒寄存服务,当科学家发表研究论文时,他们可以将相关的质粒寄存在 Addgene,由 Addgene 提供质量控制、购买资质审核,签署合规性文件、产品运输和记录保存等服务,免去了科研人互相联系和邮寄质粒的滞后性,将其从繁琐的事务中解放出来。

这些被记录到科学论文里的质粒们远渡重洋,走遍世界,为人类科研事业的进步增砖添瓦。

例如,在平台上能看到基因编辑先驱之一张锋院士实验室的经典质粒,后面还贴上了文献来源 — 在 Science 杂志发表的研究论文 Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells,令人一目了然,工作效率翻倍。

当然,这些质粒的使用仅限学术机构和非营利组织哦,小伙伴们在使用院士同款质粒时,也要爱惜个人学术羽毛,不能随意用其从事商业活动。


来源:Addgene 官网


来源:Addgene 官网

质粒构建非一朝一夕的功夫,还得仔细揣摩,愿小伙伴们构建一个成功一个。大家还有什么经验要分享吗?欢迎在留言区讨论。

题图来源:图虫创意

我们长期为科研用户提供前沿资讯、实验方法、选品推荐等服务,并且组建了 70 多个不同领域的专业交流群,覆盖神经科学、肿瘤免疫、基因编辑、外泌体、类器官等领域,定期分享实验干货、文献解读等活动。

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