血浆DNA提取试剂的选择标准

血浆DNA，又称血液循环DNA、游离DNA，是指血液中游离于细胞外的DNA，其来源主要有三：白细胞崩解释放的DNA、坏死组织特别是肿瘤组织释放入血液的DNA和感染病毒、细菌的DNA。近几年来，随着基因诊断技术的发展，游离DNA的应用价值越来越大，如优生筛查、肿瘤早期诊断、遗传病检测和病原体感染基因检测等。但血液中游离DNA含量一般较低，片段较小，不易提取，这大大影响了游离核酸的基因检测和各种研究的开展。

游离DNA提取方法一般有TRizol方法、离心柱法、磁珠法。其中，Trizol方法与离心柱相比，提取效果相当，但是因其对操作者带来的毒性，现在越来越被弃用。磁珠法比较适合机器自动化提取，如果没有核酸提取仪，只是使用磁力架配套提取，磁珠法的操作就比较麻烦且容易导致样本交叉污染。另外，根据研究，磁珠法的核酸提取得率不如离心柱法。如果要提取的游离核酸的量比较低，最好选择离心柱法。对于游离DNA含量较低的样本或比较珍贵的样本或样本总数不是很多的实验室，首选的核酸提取方法应是离心柱法。

离心柱法游离DNA提取原理主要是样本裂解后，DNA在高盐条件下与硅胶膜结合，再在低盐、高PH值时将DNA从硅胶膜上洗脱下来。面对各种品牌的离心柱法提取试剂盒，哪种才是最适合的呢？目前国内常用的离心柱法游离DNA提取试剂盒有国内品牌Biog、国际品牌Q、国内品牌T等。我们以下就几种游离DNA提取试剂盒进行比较。

一、有较高的提取得率。核酸提取得率的确定，常用的是使用紫外分光光度计的方法。但是，血清、血浆样本中游离核酸含量较低，如果直接用紫外法检测，得出的数值并不准确，而且多次测量的结果会变异很大。关于提取得率，Qiagen的研究数据是1ml正常血浆样本cfDNA得为7.35ng左右，但如果白细胞大量凋亡，血浆中的游离DNA量会有所增加，肿瘤病人的血浆DNA会大幅增加。有些研究者提取血浆DNA后习惯于先用紫外检测浓度，发现紫外检测不出来或浓度很低时便认为提取失败，放弃后面进一步的实验，其实并不可取。我们可以把紫外读数作为参考，但是不能作为判断得率的唯一标准，最好还是要做个PCR或荧光定量。根据Qiagen公司的实验，血清血浆的量与提取的核酸量成正比。因而，如果要提高核酸得率，可通过增加血清或血浆的量来实现。一般地，做血浆或血清核酸提取，样本量最好在1ml以上。如果1ml或更大量样本得不到满意的检测结果，则应及时考虑更换提取试剂盒。目前国内常用的血浆DNA提取试剂有国际品牌Q、国内品牌T、国产品牌Biog等，我们实验室使用下来，Biog的核酸提取得率较高，1ml肺癌病人血浆DNA得率在85ng左右，Q的得率在72ng左右，T的得率在63ng左右，基本上都能满足下游PCR实验的需求。当然，如此低的浓度直接测OD值不太容易，如果使用Nanodrop2000c，其检测下限为2ng/ul。如洗脱液为30ul，则需要1ml左右的血浆才能检测出来。显然，如果是健康人的血浆，1ml血浆的DNA浓度更低，紫外可能根本就检测不出来。因而，血浆DNA提取完成以后，最好直接做PCR，紫外检测的意义不大。

二、提取的核酸纯度高。核酸纯度一般根据OD260/OD280比值来判断。一般说来，试剂盒提取的DNA 其OD260/OD280比值应在1.6--1.8之间。如果提取的DNA溶液OD260/OD280比值小于1.6，通常说明有蛋白质或酚、多糖等的污染。如果提取的DNA溶液OD260/OD280>1.9,则表明有RNA污染。使用Q公司血浆DNA提取试剂盒提取的血浆DNA, OD260/OD280一般在1.7-1.9之间；使用Biog血浆游离DNA提取试剂盒提取的血浆DNA, OD260/OD280一般在1.6-1.9之间，使用T公司血浆DNA提取试剂盒提取的血浆DNA OD260/OD280比值也在1.6-1.9之间。Q公司提取DNA的纯度似乎优于国产试剂，但我们提取的DNA是用于PCR检测，结果并无明显影响。可能因为Biog公司血浆游离DNA提取试剂盒提取的血浆DNA得率较高的原因，同样的DNA加样体积（2ul），Biog试剂盒提取的DNA 荧光定量PCR检测结果CT值要优于Q公司试剂盒提取的DNA。

三、操作简便性。操作简便性也是血浆DNA提取试剂选择的一个重要因素。操作过于复杂，不仅费时费力，还容易导致样本间的交叉污染，也容易损失样本。特别是用于临床检测或样本较多情况下的检测，操作复杂如果导致交叉污染会引起误诊，还会影响出检测报告的时间。因而，选用操作简便、流畅的提取试剂盒非常重要。就我们曾经用过的以上三种提取试剂盒来说，Q公司的血浆DNA提取试剂盒提取过程大约30min，从样本处理开始需要个10步骤；T公司血清/血浆游离DNA提取试剂盒整个提取过程需要约40min，从样本开始处理10个步骤；B公司的Biog血浆游离DNA提取试剂盒提取过程大约25min，从样本开始处理8个步骤，Biog公司的血浆游离DNA提取试剂盒在操作简便性上具有一定优势，更适合于较多样本的检测。据了解，该产品已通过药监局备案，也更适合临床样本的检测。

综合看来，与国外知名品牌相比，国产试剂盒在血浆DNA提取纯度上稍有不足，但在提取得率和操作简便性上基本没有区别，有些品牌还略有优势，可根据实验需求进行选择。对纯度要求较高的实验，可选择Q等国外知名品牌，如果对提取量要求较高或提取后主要进行PCR或分子杂交之类的实验，可考虑选择Biog等国产品牌。