微源实验室针对胰高血糖素样肽1GLP-1类似物的杂质研究

司美格鲁肽（Semaglutide，又称索马鲁肽）与替尔泊肽（Tirzepatide，又称替西帕肽）等GLP-1多肽药物成为目前减重治疗的“明星药品”。独特的临床疗效，让GLP-1类似物正成为越来越重要的药物类别和研发热点。

1. GLP-1类似物

GLP-1全称为Glucagon-Like Peptide-1，即胰高血糖素样肽-1，是一种主要由肠道L细胞所产生的激素，属于肠促胰岛素的一种。1971年肠促胰素效应提出，胰高血糖素样肽（GLP-1）应运而生。

研究表明人体内除了胰高血糖素样肽1（GLP-1）之外，还有一种肠促胰素-葡萄糖依赖性胰岛素释放肽（GIP），两者都可以通过促进胰岛素的分泌的机制来调节血糖[1]。

但由于受体内二肽基肽酶4（DPP-4）以及中性肽链内切酶（NEP）的降解，导致GLP-1在体内的半衰期很短，图为DPP-4在Ala8和Glu9氨基酸之间切割GLP-1。

DPP-4酶切位点

NEP通过在中心和C末端肽结构域内的六个位点：Asp15-Val16、Ser18-Tyr19、Tyr19-Leu20、Glu27-Phe28、Phe28-Ile29和Trp31-Leu32处裂解，在GLP-1降解中起次要作用。

故通过以GLP-1为中间体，通过结构修饰[2]、氨基酸序列改造等方式以延长半衰期[3]，出现了利拉鲁肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽、索马鲁肽等药物，在糖尿病领域效果显著。

其中脂肪酸的共价连接，称为酰化，被广泛用于控制治疗肽的半衰期。比如地特胰岛素，B链30号位点的苏氨酸去除并在29号位点的赖氨酸添加了一个十四碳脂肪酸（肉豆蔻酸），肉豆蔻酸的结合使得半衰期从4-6 分钟（胰岛素）延长到5-7小时（地特胰岛素）。

同样的还有德谷胰岛素，B链30号位点的苏氨酸被去除并通过一个谷氨酸连接子，在29号位点的赖氨酸连接上一个十六碳脂肪酸侧链，使得其半衰期更长。

酰化GLP-1成功的例子是利拉鲁肽。其在GLP-1序列中的第34位Lys替换为Arg，即得到Arg34-GLP[7-37]，在其26位Lys增加一个16碳棕榈酰脂肪酸侧链即形成长效GLP-1类似物利拉鲁肽。

一旦给药，脂肪酸链会导致利拉鲁肽低聚，从而在注射部位形成低聚物。利拉鲁肽的自缔合导致其延迟吸收到系统循环中，使得半衰期延长到约为9-13小时，将使用频次轻松降为每天注射一次。

利拉鲁肽结构示意图

司美格鲁肽是基于利拉鲁肽的下一代GLP-1 RA， 司美格鲁肽在第8位的Ala氨基酸被非天然的α氨基丁酸（Aib）氨基酸取代，以避免DPP-4降解。

一个更长的十八碳硬脂酸二酸脂肪链被引入司美格鲁肽，脂肪二酸链通过一个谷氨酸和两个8-氨基-3,6-二氧辛酸（ADO）部分连接到Lys26上，以实现对白蛋白的更高亲和力。更长的脂肪酸侧链和硬脂酸上存在末端酸基团，使得司美格鲁肽的半衰期延长至7天。

司美格鲁肽结构示意图

2.多肽类药物杂质成因

多肽类药物的有关杂质可以分为合成过程中带入的工艺杂质、降解杂质、聚合物和光学杂质等，合成多肽过程中，杂质众多，其成分也较为复杂，以下归纳了几种杂质形成机制：

a 氨基酸缺失和插入

在Fmoc-去保护中可以引起氨基酸残基的外消旋化，从而引入对映异构体杂质。氨基酸侧链的低效去保护会导致肽保护加和物，同时未受保护的侧链又可以与工艺路线中各种试剂进行反应；

b 肽降解机制

典型的β-消除，二酮哌嗪，焦谷氨酸和琥珀酰亚胺形成；

c 侧链/末链杂质

精氨酸侧链胺化产生伯胺，肽键缩合剂TSTU引入杂质；

d 二聚体

多个单体通过二硫键或酪氨酸氧化成二酪氨酸形成；

e 氧化还原

组氨酸和赖氨酸易氧化，产生2-氧代-组氨酸和氨基己二酸，色氨酸侧链在酸性条件下具有很强的反应性，易被氧化；

f 降解产物

H+或OH-催化α-β消除半胱氨酸中的C-S键等，产生新的残基；

g 残留溶剂等

如司美格鲁肽中N-甲基吡咯烷酮（NMP）、乙酸乙酯、二氯甲烷、正庚烷等的残留；

3.GLP-1类似物杂质检测

多肽类杂质的检测方法主要有(H)UPLC、毛细管电泳、LCMS、NMR、拉曼光谱、圆二色性（CD）等。以HPLC为例，通常使用乙腈、三氟乙酸为流动相（TFA对蛋白、多肽的洗脱及峰型改善），高分辨LCMS技术则在未知杂质结构确证中起到关键作用。

图为对利拉鲁肽中间体重组Arg34GLP[7-37]有关物质分析，以0.1%TFA水溶液为流动相A，0.1%TFA乙腈为流动相B，通过梯度洗脱：

重组Arg34GLP[7-37]有关物质分析图谱

其中含有许多杂质峰。对于微生物发酵所得的重组多肽，在纯化过程中难免会引入诸多未知杂质，同时极易被破坏产生新的杂质，如高温、酸碱、氧化等条件，则可通过2D-LCHMS二维高分辨液质联用技术对未知杂质峰进行定性。

4.GLP-1类似物杂质检测

针对市面上越来越多的多肽类药物的立项和上市，微源检测实验室基于丰富的药物质量研究经验和全面的技术平台优势，提供多肽类药物IND阶段的杂质研究服务，涵盖：

√ 遗传毒性杂质

√ 亚硝胺杂质

√ 元素杂质

√ 工艺相关杂质

等提供杂质研究技术服务/杂质风险评估，建立合适的分析方法，对工艺中可能存在的产品相关杂质进行全面的分析和表征，质量标准中进行控制，减少后续反应产生影响的风险。为药品生产企业、创新企业、生物技术企业和新材料研发机构提供生物药工艺杂质研究、蛋白质残留研究、药物杂质分离鉴定、元素杂质研究等多项技术服务。仪器设备齐全，覆盖全面，质管完善，确保研究工作的系统性、规范性和可追溯性，如您有相关需求，欢迎咨询！

参考文献
[1] FarillaL1,BulottaA,HirshbergB．Glucagon-like peptide 1 inhibits cell apoptosis and improve glucose responsiveness of freshly isolated human islets [J].Endocrinology,2003,144(12):5149-5158．
[2] AbuR,RabieeA,MeneilyGS,eta1．The extra pancreatic effects of glucagon-like peptide-1 andrelated peptides[J].Clafi Endocfinal Me tab,2009,94(10):1843．
[3] Saeid, Saghahazrati, Seyed Abdul Majid, Ayatollahi, Farzad, Kobarfard, Bagher, Minaii Zang.The Synergistic Effect of Glucagon-Like Peptide-1 and Chamomile Oil on Differentiation ofMesenchymal Stem Cells into Insulin-Producing Cells. [J]. Cell journal,2020,21(4):371-378.