Dev Cell | 张娟等揭示LINE1转座子在人类胚胎八细胞期调控全能性向多能性的转化

自1950年转座子在玉米基因组中被首次报道，这些能够自我复制并转移到其他随机基因位点（即“转座”）的“重复序列”在各种生物的基因组中广泛存在，长期以来被视为垃圾序列。甚至因为其在癌症等变异细胞中的活跃“转座”，一度被认为是有害序列。LINE1 （Long Interspersed Nuclear Element-1）全长约6千碱基 (kb)，携带介导‘转座’功能的蛋白质序列，是转座子家族的重要成员，约占人类基因组的17%，并在人类的24条染色体上分散分布。在正常体细胞内，通过多种调控机制，细胞会牢牢抑制包括LINE1在内的转座子活性。然而在哺乳动物发育的早期胚胎这一特殊时期，这些控制LINE1活性的“锁“被打开了，LINE1被发现活跃转录RNA并且翻译相应蛋白质【1】。这对于胚胎发育也是有害的吗？如果有害，为什么在漫长的进化中，这一调控现象得以保留？

来自加拿大多伦多大学和Lunenfeld-Tanenbaum研究所的Miguel Ramalho-Santos实验室在2018年发表在Cell的一项研究中首次证实，在小鼠干细胞（mESCs）中活跃表达的LINE1对于抑制小鼠胚胎二细胞期全能性至关重要，并且对于胚胎的正常发育不可或缺（详见BioArt报道：）【2】。然而，不同于单个位点表达的基因（如蛋白质和lncRNA基因），作为转座子序列， LINE1在亿万年的物种进化中发生着序列突变和随机“转座“的发生，导致LINE1在小鼠和人基因组中的分布位点毫无同源保守性（图4）【3】。因而， 人类特异的LINE1序列是否也在早期胚胎中发挥了重要的调控功能，这一关键问题尚待解答。

2024年10月15日，Ramalho-Santos实验室在Developmental Cell杂志上发表了题为LINE1 and PRC2 control nucleolar organization and repression of the 8C state in human ESCs的研究论文进一步揭示了LINE1在人类干细胞（hESCs）中抑制八细胞（8C）期全能性（totipotency）的重要功能，并深入阐明了LINE1在调控细胞核三维结构分布及维持染色质状态中的作用机制。

该研究首先在多种培养液体系中培养的hESCs中进行了LINE1 RNA的敲低实验，结果均导致细胞转录组向8C转录状态的转变，尽管hESCs的多能性（pluripotency）状态对8C基因诱导的效率有直接影响。单细胞转录组测序进一步显示，敲低LINE1的实验组比对照组hESCs富集了约65倍的类8细胞期细胞（8CLCs）（图1）。

图1 – 在hESCs中LINE1 RNA 敲低引起了 8CLCs的富集。

为了揭示LINE1抑制8C转录组的机制，研究人员在hESCs中进行了多项测序以测绘：与核仁及核膜相关联的DNA序列（NAD-seq and LAD-seq）；LINE1 RNA结合的DNA位点 （LINE1 ChIRP-seq）；染色质修饰的DNA位点（H3K27ac, H3K27me3 and H3K9me3 ChIP-seq）。通过将这些基因组测序数据与LINE1 敲低的转录组测序结果等进行交叉分析，并结合DNA 或RNA免疫杂交（DNA-FISH, RNA-FISH）显微成像技术的进一步验证，发现LINE1富集在核仁和核膜的这两个异染色质（heterochromatin）富集的区域，与小鼠LINE1的富集区域相同【4】。然而，LINE1 RNA结合的位点临近基因，并没有发生LINE1 敲低诱导的去抑制，该结果不支持LINE1作为直接的抑制因子的假设。分析发现，LINE1敲低后诱导表达的基因富集了PRC2（Polycomb抑制复合物2）和H3K27me3靶向的基因，提示PRC2介导的H3K27me3抑制性修饰可能参与了8C转录组的抑制。PRC2免疫沉淀实验表明LINE1 RNA与PRC2共同富集。进一步实验显示，抑制PRC2同样激活了8C基因的转录，与LINE1敲低引发的转录组变化呈正相关。这些结果说明LINE1可能与PRC2协同作用以抑制8C转录组（图3）。后续研究比较了H3K27me3在LINE1 敲低组和对照组中的水平，结果显示敲低LINE1显著降低了H3K27me3的修饰，并在一些关键8C基因的启动子区域呈现。

图2 – 19号染色体与核仁的接触在hESCs和8CLCs中发生着实时变化。

有趣的是，该研究发现多个关键的8C基因都位于19号染色体上，进而进行了一系列的染色体之间的比较。结果发现LINE1敲低后诱导表达的基因、H3K27me3修饰的基因，及PRC2抑制后上调的基因均呈现了在这一染色体上的富集。此外，LINE1敲低导致的H3K27me3修饰下调在19号染色体上比其他染色体更为显著。通过LAD-seq和NAD-seq空间测序，研究人员还发现19号染色体在干细胞中只与核仁区相关联，而鲜少与核膜区有接触，表明核仁区域参与了抑制19号染色体基因的表达。进一步研究通过DNA-FISH比较hESCs和8CLCs中19号染色体与核仁的接触，发现其在8CLCs中显著减少（图2）。这一系列关于19号染色体的有趣观察表明，核仁在抑制8C转录组中发挥着重要作用，而此前的小鼠研究也多次报道了核仁在抑制2C基因中的关键作用【5,6】。因而，该研究通过抑制RNA Polymerase I和敲低重要的核仁蛋白Nucleolin对hESCs中核仁实施破坏，证实核仁破坏同样导致了8C基因的上调（图3）。进一步研究揭示LINE1 敲低和PRC2抑制也会破坏核仁的正常结构。PRC2抑制的细胞中，19号染色体与核仁的接触也显著减少了，类似于8CLCs中的情况。

图3 – LINE1 RNA 和 PRC2 通过促使核仁成熟从而抑制 hESC 中 8C 状态的模型。

总体说来，尽管人类特异性LINE1与小鼠特异性LINE1在基因组中缺乏同源保守性，二者在细胞核三维空间中的富集状态却表现出相似性。LINE1在核仁区域的富集与表观染色质调控的协同作用促进了核仁结构的成熟，从而对于早期胚胎发育中基因的程序性表达发挥了重要作用（图4）。这项研究不仅加深了人们对转座子和人类早期胚胎发育调控的认知，也在机理探索中层层深入揭示了细胞核内组织分区和染色质调控之间的复杂关联。对于这些知识和机制的探索将有助于全面了解人类基因组调控的奥秘，并为发育及疾病模型的研究提供新的视角。

图4 – LINE1功能保守推测模型。

Ramalho-Santos实验室博士后张娟博士为本文第一作者，并与Dr. Miguel Ramalho-Santos共同担任通讯作者。该研究得到了广州生物医药与健康研究院的Dr. Miguel A. Esteban实验室，多伦多大学的Jeffrey L. Wrana实验室和Dr. Michael M. Hoffman实验室，以及麦吉尔大学健康中心的 Dr. Tony Kwan实验室的大力支持。

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2024.09.024

制版人：十一

参考文献

1. Percharde, M., Sultana, T., and Ramalho-Santos, M. (2020). What Doesn’t Kill You Makes You Stronger: Transposons as Dual Players in Chromatin Regulation and Genomic Variation.BioEssays42, 1900232. https://doi.org/10.1002/bies.201900232.

2. Percharde, M., Lin, C.-J., Yin, Y., Guan, J., Peixoto, G.A., Bulut-Karslioglu, A., Biechele, S., Huang, B., Shen, X., and Ramalho-Santos, M. (2018). A LINE1-Nucleolin Partnership Regulates Early Development and ESC Identity.Cell174, 391-405.e19. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.05.043.

3. Furano, A.V., Duvernell, D.D., and Boissinot, S. (2004). L1 (LINE-1) retrotransposon diversity differs dramatically between mammals and fish.Trends in Genetics20, 9–14. https://doi.org/10.1016/j.tig.2003.11.006.

4. Lu, J.Y., Shao, W., Chang, L., Yin, Y., Li, T., Zhang, H., Hong, Y., Percharde, M., Guo, L., Wu, Z., et al. (2020). Genomic Repeats Categorize Genes with Distinct Functions for Orchestrated Regulation.Cell Reports30, 3296-3311.e5. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.02.048.

5. Xie, S.Q., Leeke, B.J., Whilding, C., Wagner, R.T., Garcia-Llagostera, F., Low, Y., Chammas, P., Cheung, N.T.-F., Dormann, D., McManus, M.T., et al. (2022). Nucleolar-based Dux repression is essential for embryonic two-cell stage exit.Genes Dev.36, 331–347. https://doi.org/10.1101/gad.349172.121.

6. Yu, H., Sun, Z., Tan, T., Pan, H., Zhao, J., Zhang, L., Chen, J., Lei, A., Zhu, Y., Chen, L., et al. (2021). rRNA biogenesis regulates mouse 2C-like state by 3D structure reorganization of peri-nucleolar heterochromatin.Nat Commun12, 6365. https://doi.org/10.1038/s41467-021-26576-2.

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