NKT细胞免疫治疗的现状和未来

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前言

目前，肿瘤免疫治疗方兴未艾，群雄并起，其中最有效的治疗策略之一就是过继细胞转移疗法（ACT）。嵌合抗原受体（CAR）和工程化T细胞受体（TCR）是近年来主要的过继性T细胞免疫疗法。

自然杀伤T（NKT）细胞是脂质反应性T细胞的一个子集，可增强抗肿瘤免疫。基于NKT细胞的免疫治疗在临床前展现出富有前景的治疗效果，然而在临床治疗却没有取得明显的效果。目前，一些新的治疗策略正在开发应用于NKT细胞疗法，有望在未来的临床治疗中取得突破。

NKT细胞

NKT细胞是脂质和糖脂反应性T淋巴细胞的一个子集，共表达与NK细胞相关的标记物（NKp46，NK1.1）。NKT细胞在肿瘤免疫监测和抗肿瘤免疫中起着重要作用。与MHC I或II识别肽抗原的传统T细胞不同，NKT细胞识别通过MHC I样分子CD1d呈递的内源性和外源性糖脂。

基于TCR重排和糖脂反应性，NKT细胞可分为两个主要亚群：I型和II型NKT细胞。I型NKT（又称iNKT）细胞表达恒定的重排TCRα链与限制性的TCRβ链。在小鼠中，Vα14Jα18（TRAV11-TRAJ18）与Vβ7（TRB29）、Vβ8.2（TRB13-2）或Vβ2（TRBV1）配对；在人类，Vα24Jα18（TRAV10-TRAJ18）与Vβ11（TRBV25-1）配对。识别糖脂抗原后，iNKT细胞迅速分泌免疫调节细胞因子，包括IFN-γ、TNF和IL-4，以影响下游免疫活性。人类iNKT细胞可以是CD4，CD8双阴性（CD4-CD8-), 而小鼠的NKT细胞是CD4+或CD4-CD8-。此外，iNKT细胞可分化为NKT1、NKT2和NKT17亚群，与Th1、Th2和Th17 T细胞亚群相似。

II型NKT细胞具有更多样的Vα重排序列（包括TRAV7、TRAV9和TRAV12），有助于识别自身脂质，如硫酸脑苷脂或溶血磷脂酰胆碱。多项研究表明，通过给予硫酸脑苷脂激活II型NKT细胞可增加肿瘤生长并增强转移，表明其具有促肿瘤作用，而iNKT细胞则表现出强大的抗肿瘤活性。

iNKT细胞介导的抗肿瘤作用

活化的iNKT细胞可通过四种机制提供抗肿瘤免疫：直接肿瘤溶解、招募和激活细胞毒性固有和适应性免疫细胞、抑制肿瘤微环境（TME）中的抑制细胞以及促进肿瘤靶向免疫记忆。

直接或间接靶向

iNKT细胞可以直接或间接靶向肿瘤细胞。iNKT细胞有能力通过穿孔素、颗粒酶B和TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）途径介导针对CD1d阳性肿瘤细胞的直接细胞溶解活性。体外和体内研究表明，iNKT细胞介导的细胞毒性与肿瘤细胞表面CD1d表达增加有关，导致肿瘤细胞溶解增强和转移率降低，而CD1d的下调与iNKT细胞识别降低、肿瘤逃逸和恶性程度增加有关。

在肿瘤细胞上缺乏CD1d表达的情况下，iNKT细胞可能被CD1d+APC激活，包括树突状细胞（DC）、B细胞、髓源性抑制细胞（MDSC）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。iNKT细胞的反应在很大程度上取决于呈递糖脂的APC。激活后，iNKT细胞可分泌大量促炎细胞因子，包括IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ和TNF，这些细胞因子影响广泛的免疫细胞，包括DC、巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞以及T和B细胞。此外，活化的iNKT细胞可以通过CD40/CD40L和CD1d/TCR相互作用积极招募和诱导DC成熟。

免疫抑制的调节

TAM是在TME中高频出现的免疫抑制性免疫细胞。TAM有助于肿瘤进展和NK、iNKT和T细胞反应的抑制。在神经母细胞瘤中，iNKT细胞可以通过CD1d依赖机制共定位和裂解TAM。此外，iNKT细胞可以将M2极化TAM重新编程为炎性M1巨噬细胞，减少TAM介导的免疫抑制。

MDSC诱导NK和T细胞无能，促进免疫抑制和肿瘤生长。此外，它们可以重塑TME，增加转移率。在甲型流感感染模型中，iNKT细胞可以以CD1d和CD40依赖性方式抑制精氨酸酶-1和NOS2介导的MDSCs抑制活性。此外，NKT细胞可以刺激负载α-GalCer的MDSC转化为成熟的APC，能够诱导NK和T细胞免疫反应。

此外，II型NKT细胞在TME中出现频率较高，具有免疫抑制作用，增加肿瘤进展和转移。iNKT细胞的激活减少了II型NKT细胞的数量。

肿瘤免疫记忆的形成

免疫记忆的产生对于持久的抗肿瘤免疫反应和预防肿瘤复发至关重要。肿瘤抗原或交叉反应的外源抗原的激活可诱导幼稚T细胞进行扩增和分化，以获得适当的效应器功能来靶向癌细胞。

CD8α+树突状细胞在MHC I交叉呈递中表现出色，已证明iNKT细胞可直接促使CD8α+树突状细胞进行交叉启动，即使在没有CD4+T细胞的情况下也是如此。在多种肿瘤模型中，NKT细胞活化被证明能增强CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。

虽然大多数iNKT细胞缺乏CD62L，但最近的一项研究表明，在糖脂刺激后，CD62L+iNKT细胞增加，并且比CD62Lneg iNKT细胞持续时间更长。CD62Lneg iNKT细胞获得衰竭表型（PD-1，TIM-3，细胞因子产生减少）并迅速发生凋亡，而CD62L+iNKT细胞继续增殖并产生大量细胞因子。

基于NKT的细胞免疫疗法

由于iNKT细胞在免疫监测和抗肿瘤免疫中的重要作用，基于iNKT细胞的免疫治疗已成为一个重要的研究领域，目前已经使用多种策略来靶向癌症。

给予游离α-GalCer

在临床前试验中，可以预防性地、同时或在肿瘤接种后给予游离α-GalCer。注射游离α-GalCer后，iNKT细胞迅速增殖并产生TNF、IL-2、IL-4和IL-13，随后出现IFN-γ反应，多次注射偏向Th2反应。

虽然在多个小鼠模型中，肿瘤接种后给予游离α-GalCer具有一定的抗肿瘤作用，但抗肿瘤反应有限。因此，游离α-GalCer通常与细胞因子或其他免疫疗法联合使用，以提高治疗效果。在I期临床试验中，α-GalCer的给药耐受性良好，没有剂量限制毒性；然而，它未能产生临床反应，24名患者中只有7名SD。低疗效可能归因于基线时低iNKT细胞数量，因为只有高iNKT细胞数量的患者表现出NK细胞毒性和稳定疾病。

过继转移呈递α-GalCer的DCs

负载α-GalCer的DC已被用于克服游离α-GalCer的低免疫原性和无能诱导。由于CD40和IL-12的共刺激信号传导，将α-GalCer加载到DC上会导致iNKT细胞更强的激活和更少的无能诱导。

在多种肿瘤模型中，与游离糖脂给药相比，α-GalCer负载的DC可减少肿瘤生长和转移，从而延长生存期。负载α-GalCer的DC增加了iNKT的增殖、活化和IFN-γ的产生。此外，iNKT细胞的活化增强导致NK和CD8+T细胞的活化和IFN-γ产生增加。

在骨髓瘤和头颈癌的临床试验中，成熟的负载α-GalCer的APC耐受性良好，无严重不良事件。治疗增加了IFN-γ的产生和iNKT细胞的扩增，导致许多患者病情稳定，中位生存时间延长。在非小细胞肺癌的I期和I/II期临床试验中，负载α-GalCer的APCs治疗耐受性良好，仅导致I级和II级不良事件。对治疗反应良好的患者表现出IFN-γ产生增加和iNKT细胞扩增。中位生存时间为31.9个月，而所有患者的中位生存时间为18.6个月。

过继转移活化的iNKT细胞

癌症患者通常iNKT细胞数量较少和/或功能降低，限制了α-GalCer治疗的疗效。为了克服这一限制，已从患者来源的PBMC中分离出iNKT细胞，并在体外扩增后过继转移回患者体内。在临床前模型中，过继转移活化的iNKT细胞可增加黑色素瘤转移模型中iNKT细胞的细胞毒性、肿瘤消退和总生存率。相反，在转移性4T1乳腺癌模型中，NKT细胞单独过继或与游离α-GalCer疗法或负载α-GalCer的DC联合使用并不能改善预后。

使用iNKT细胞过继转移治疗非小肺癌和晚期黑色素瘤的临床试验未报告严重不良事件。患者的循环iNKT细胞数量和IFN-γ生成增加，但很少有患者肿瘤进展减少，表明该治疗无效。将扩增的iNKT细胞过继转移与负载α-GalCer的DC相结合，可提高过继NKT细胞转移的效率。与单独的iNKT过继转移相比，联合治疗可使一些患者获得部分应答。

作为癌症疫苗佐剂

iNKT细胞在识别通过CD1d呈递的保守脂质抗原方面的作用，以及它们通过细胞因子信号协调抗肿瘤免疫反应的能力，使其成为癌症疫苗开发的诱人靶点。iNKT细胞的配体，如α-GalCer，可与肿瘤抗原共同使用，作为佐剂发挥作用，增加对肿瘤的适应性免疫反应。

在临床前动物模型中，与肿瘤抗原联用的α-GalCer可提高小鼠的总体存活率。用α-GalCer和OVA进行鼻内接种可诱导体液和细胞免疫反应，导致细胞因子分泌、CTL反应和IgG产生增加。目前，还没有在癌症疫苗中使用iNKT细胞配体的注册临床试验。

CD1d抗体融合蛋白

CD1d阳性肿瘤或更易受iNKT细胞介导的裂解，而CD1d下调是避免检测的常见逃避策略。因此，为了增加iNKT细胞对肿瘤的靶向性，研究了将iNKT细胞直接导向肿瘤的CD1d抗体融合蛋白。

目前，针对HER2、CEA和CD19的CD1d抗体融合蛋白已经开发出来。在表达HER2的B16黑色素瘤模型中，以HER2为靶点的CD1d抗体融合蛋白治疗增加了iNKT细胞炎性细胞因子的产生和肿瘤细胞的靶向溶解，减少了转移形成。此外，iNKT细胞增强了DC、NK细胞和CD8 T细胞的激活，增加了肿瘤的整体免疫招募和靶向性。重要的是，CD1d抗体融合蛋白具有靶向特异性，显示出良好的安全性。

CAR-NKT细胞

CAR-T细胞疗法在靶向B细胞恶性肿瘤方面取得了显著的临床成功。iNKT细胞已被设计出表达针对糖脂和蛋白质抗原的CARs。此外，除CAR外，CAR-NKT细胞还共同表达恒定的TCR，维持其对糖脂抗原的反应性。相反，CAR-T细胞中的内源性TCR是多克隆的，大多数CAR-T细胞只能通过其CAR进行反应。

靶向CSPG4、GD2和CD19的CAR-NKT细胞已经开发出来，靶向GD2和CD19的CAR-NKT细胞正在进行临床试验。一项I期临床试验（NCT03294954）已经开始，检测难治性神经母细胞瘤中的抗GD2 CAR-NKT细胞的疗效和安全性。初步结果表明，10名入选患者的治疗是安全的，其中1名完全缓解，1名部分缓解，3名患者病情稳定。

目前，CD19 CAR-NKT细胞正在进行一项I期临床试验（NCT03774654），检测复发和难治性B细胞恶性肿瘤中的安全性和有效性。在I期试验的两名患者中，一名患者表现出完全响应，另一名患者表现出部分响应，两名患者都没有任何CRS或GvHD的迹象。重要的是，本研究中使用的CAR-NKT细胞是同种异体的，证明了“通用”疗法的潜力。

基于NKT细胞的联合疗法

改进现有疗法的一种方法是将其与产生协同反应的其他疗法相结合。联合疗法也可能提高iNKT细胞免疫疗法的临床疗效。在临床前实验中，iNKT细胞免疫疗法已经与化疗、溶瘤病毒和其他免疫疗法进行了联合试验。

联合化疗

迄今为止，来那度胺是临床试验中唯一与iNKT细胞免疫疗法联合使用的化疗药物。在一项I期临床试验中，无症状骨髓瘤患者接受载α-GalCer的DC联合来那度胺治疗。治疗耐受性良好，仅有一名患者出现3级不良事件。治疗导致iNKT细胞、NK细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞的激活增加，显示出强烈的先天免疫激活。此外，NKG2D在NK细胞上的表达显著增加，表明NK细胞的细胞毒性潜力增加。总的来说，治疗导致除一名患者外所有患者的肿瘤相关免疫球蛋白降低，表明治疗降低了肿瘤负担。联合治疗的成功强调了进一步临床试验的必要性。

与溶瘤病毒联合

迄今为止，还没有临床试验将溶瘤病毒与iNKT细胞免疫疗法相结合。然而，临床试验表明溶瘤病毒可以改善其他免疫疗法的效果。溶瘤病毒疗法与iNKT细胞活化疗法相结合的临床前的成功结果表明，有必要在临床试验中进一步检查这种联合疗法。

联合免疫治疗

联合治疗的一个有趣的选择是联合iNKT细胞治疗和免疫检查点抑制剂。α-GalCer激活iNKT细胞后，IFN-γ大量释放，随后PD-1表达增加，导致无能和抗肿瘤功能抑制。因此，联合iNKT细胞免疫治疗和阻断PD-1/PD-L1轴的检查点抑制剂可能提高治疗效果。事实上，在临床前模型中，α-GalCer联合抗PD-1或抗PD-L1可防止iNKT细胞无能增加iNKT细胞的抗肿瘤活性。此外，iNKT细胞免疫治疗可以克服PD-1耐药肿瘤中的CD8+T细胞无能。临床试验正在测试PD-1/PDL-1阻断剂和iNKT细胞免疫治疗的组合（NCT03897543）。

NKT细胞疗法面临的挑战和应对

iNKT细胞免疫治疗面临的最大挑战是癌症患者中iNKT细胞的低浸润和功能降低。再加上肿瘤细胞CD1d的下调，治疗效果可能会受到限制。此外，iNKT细胞在用游离α-GalCer治疗后诱导无能表型，降低了多剂量治疗的疗效。

另一个挑战是从免疫抑制的癌症患者中获得大量自体DC和iNKT细胞，从而限制可扩增和过继转移的细胞数量。此外，培养和分化细胞进行过继转移需要数周时间，导致一些患者无法接受治疗或死于疾病[。为了应对这些挑战，许多研究对iNKT细胞免疫疗法进行了改进。

改进糖脂输送

由于游离α-GalCer的低效性和难以获得大量自体DC，一些研究检测了α-GalCer通过载体（如纳米颗粒、人工抗原递呈细胞、外泌体和脂质体）传递的可能性。与游离的α-GalCer相比，载体结合的α-GalCer的递送增加了iNKT细胞的扩增和细胞因子的释放，从而降低了肿瘤负荷。这主要是由于DC细胞的摄取和表达增加，以及下游NK和CD8+T细胞反应增加。

选择糖脂替代物

几乎所有iNKT细胞免疫治疗的临床试验都使用α-GalCer（KRN7000）刺激iNKT细胞；然而，越来越多的修饰糖脂可能提供更高的治疗效益。例如，α-C-GalCer将α-GalCer中发现的O-糖苷键替换为C-糖苷键，从而增加IFN-γ和IL-12的产生。

7DW8-5是一种候选糖脂，它的酰基链较短，末端为氟化苯环。与α-GalCer相比，7DW8-5对iNKT细胞的CD1d和TCR具有更强的亲和力，在多种疫苗模型中，7DW8-5刺激iNKT细胞可增加Th1和CD8+T细胞反应。

类似地，一种被称为ABX196的修饰糖脂作为疫苗佐剂已经产生了有希望的结果。在黑色素瘤、结肠癌和膀胱癌模型中，ABX196单独或与抗PD-1联合使用可增加肿瘤消退和总生存率。ABX196联合PD-1抑制剂目前正在进行一期临床试验（NCT03897543）。

诱导多能干细胞衍生的iNKT细胞

癌症患者通常会减少iNKT细胞的数量和功能，从而限制了iNKT细胞免疫疗法的疗效。此外，很难从免疫抑制的癌症患者获得足够的PBMC来体外扩增和输送iNKT细胞。一种应对策略是使用来自患者组织的诱导多能干细胞（IPSC）。iPSC诱导的iNKT细胞能够分泌大量IFN-γ。此外，体内试验表明，iPSC衍生的iNKT细胞在转移到小鼠体内时保持了其抗肿瘤功能。

靶向Ⅱ型NKT细胞

iNKT细胞和II型NKT细胞在肿瘤免疫调节中发挥相反的作用，并相互交叉调节。因此，靶向II型NKT细胞可能是缓解肿瘤介导的iNKT细胞免疫抑制并增强抗肿瘤免疫的治疗方法。最近发现的II型NKT细胞硫酸脑苷脂抗原的一种亚型C24:2被证明能显著减少肺转移的发生。

小结

iNKT细胞在免疫监测和抗肿瘤免疫中起着重要作用。基于NKT细胞的免疫疗法具有众多优势，相比于CAR-T细胞治疗，NKT细胞治疗作用时间更久，更能够抑制癌症的复发和转移，将可能成为实体瘤等癌症的重要治疗方式。

虽然，目前临床研究仍然没有取得突破，但一些新的治疗策略，包括载体化的α-GalCer、替代性糖脂和联合疗法，正在显示出改善的临床前结果。随着免疫细胞治疗实体瘤技术的不断突破，NKT细胞免疫治疗行业将会得到快速发展，相信未来基于NKT细胞的免疫疗法将会大放异彩。

参考文献：

1.The Current Landscape of NKT CellImmunotherapy and the Hills Ahead. Cancers (Basel). 2021 Oct; 13(20): 5174.

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