熔解曲线技术路线简介

在实时荧光定量PCR（qPCR）实验中，当双链DNA受热时，其互补碱基之间的氢键会逐渐断裂，导致双链分离成两条单链，这一过程被称为DNA的“熔解”。总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度（Tm），不同序列的DNA，GC含量和分布不同，Tm值也不同。随着温度的升高，DNA的荧光强度会发生变化，通过监测这种变化，绘制出的图即为DNA的熔解曲线。

图1.qPCR熔解曲线示意图

‌熔解曲线技术是利用上述原理区分不同DNA序列的技术，主要实现方式有：染料法熔解曲线技术（高分辨率溶解曲线HRM）和荧光PCR探针熔解曲线技术（多色熔解曲线分析技术MMCA）。

高分辨率溶解曲线HRM是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。其原理是通过PCR扩增得到大量目标序列，然后直接对其运行高分辨率熔解程序，在温度升高过程中，双链DNA逐渐解链，嵌入DNA双链中的染料（SYBR Green I等）也随之脱落，荧光信号减弱，直至双链DNA完全解链，荧光信号减弱至最低，通过监测这一过程来分析DNA序列‌。

HRM技术在医学领域有着广泛的应用。例如，在高血压患者中筛查MTHFR基因多态性，通过HRM技术可以快速、准确地检测MTHFR C667T多态性，从而帮助诊断H型高血压‌。此外，HRM技术还应用于单基因遗传病诊断和产前诊断，如筛查非缺失型α+-地中海贫血Hb Quong Sze，建立了一种快速、简便、廉价的分子筛查方法‌。在肿瘤分子检测中，HRM技术与测序技术相结合，提高了检测的准确性和成本效益‌。

图2.HRM检测SNP结果示意图

图3.HRM检测DNA甲基化程度结果示意图

染料法虽然方便快捷但不具有特异性。染料能与所有双链 DNA 结合，即便是在高分辨率熔解曲线，同样不能定位基因突变的具体位置。为了满足精确定位的的需求，探针熔解曲线技术正在飞速发展，该技术利用荧光探针代替染料与目的基因相结合，分析探针与目的片段的解链温度，即可达到基因分型的目的。在多色探针溶解曲线技术中，DNA分子会在不同的温度下产生不同“熔解峰”，每个峰对应一段DNA序列的熔化。通过分析这些峰的数量、位置和形状等信息，可以准确的确定DNA序列的组成、杂交强度、配对稳定性等信息。另外，探针可选择不同波长的荧光标记，充分利用荧光 PCR 仪的多个通道，实现多基因多位点的并行性检测。

例如，厦门致善的MeltArray”的荧光PCR新技术，宏微特斯的 EMPA 技术以及韩国 Seegene 公司的 TOCE 技术等。

图4. MMCA在卡马西平不良反应相关基因检测中的运用

图5. MMCA技术适用的应用场景