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中科院1区-if27+: 旋覆花内酯靶向E2泛素结合酶UbcH5c抑制胰腺癌生长和转移

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旋覆花(Inula japonica Thunb),又名旋复花,为菊科旋覆花属多年生草本植物,是我国一种常用中药,《本草纲目》早有记载“旋复花性味咸,归肝胃肺经,具有利湿消痰、行气散结之功”,现代药理学研究表明旋覆花具有显著的抗肿瘤活性,然而其有效成分、作用机制及靶标并不明确。

2022年3月10日,中国科学院基础医学与肿瘤研究所覃江江研究员和程向东教授、上海中医药大学交叉科学研究院张卫东教授合作在Molecular Cancer上发表题为“Targeting E2 ubiquitin-conjugating enzyme UbcH5c by small molecule inhibitor suppresses pancreatic cancer growth and metastasis”研究文章,发现中药旋覆花中的一种半萜内酯化合物DHPO(旋复花内酯/大花旋覆花素)能够作为UbcH5c抑制剂显著抑制胰腺癌的生长与转移。


摘要

利用公开数据集的转录组数据分析IAPs与E2的相关性,以及E2 UbcH5c在胰腺癌中的生物学功能。采用基于结构的虚拟筛选方法鉴定UbcH5c抑制剂,并采用表面等离子体共振分析和细胞热位移实验评估其结合亲和力。通过体内外实验验证了其抗癌活性,并通过转录组学和蛋白质组学分析探索了相关机制,并通过western blot、免疫荧光和qRT-PCR进行了验证。UbcH5c与iap在胰腺癌中的表达呈正相关。进一步发现UbcH5c在胰腺癌中高表达并与不良预后相关。我们发现了一种小分子UbcH5c抑制剂,称为DHPO,可直接与UbcH5c蛋白结合。DHPO抑制胰腺癌细胞活力和克隆形成,诱导细胞凋亡,抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭。该化合物可抑制ubch5c介导的IκBα降解和NF-κB活化,这对其抗癌活性至关重要。此外,DHPO抑制了两种原位胰腺肿瘤小鼠模型的肿瘤生长和转移。这些结果表明,抑制UbcH5c是一种新的有效的治疗胰腺癌的策略,DHPO代表了一类新的UbcH5c抑制剂,有可能成为进一步开发的抗胰腺癌治疗药物。

1.UbcH5c高表达与IAP表达及胰腺癌患者不良预后相关

为了确定哪些E2与IAPs协同泛素化,首先比较了胰腺肿瘤组织和正常组织之间21个E2的mRNA表达水平,并发现从UCSX xena获得的TCGA TARGET GTEx数据集中,与正常组织相比,所有这些E2的mRNA表达水平在肿瘤样本中均上调。鉴于2s在胰腺癌患者中过表达,进行了IAP家族和2s mRNA表达水平的相关性分析,并确定了6个2s作为候选药物靶点。如图1a所示,UBE2A、UBE2B、UBE2D1、UBE2D3(也称为UbcH5c)、UBE2E1、UBE2E3的mRNA表达水平与cIAP1有更强的正相关,UBE2A与XIAP (r > 0.7)的相关性更强。在6个2s中,只有UbcH5c对胰腺癌患者的总生存时间有负面影响(图1b)。此外,使用在线工具CVCDAP [28], UbcH5c在肿瘤组织中的mRNA表达相对于来自TCGA TARGET GTEx数据集的正常组织的水平显著上调(图1c),并在来自TCGA数据集的配对的邻近非肿瘤组织中显著上调(图1d)。此外,在Human protein Atlas中,胰腺肿瘤组织中的UbcH5c蛋白水平高于正常组织(图1e)。为了进一步研究UbcH5c在胰腺癌发生中的作用,利用生物信息学方法分析了TCGA数据库中胰腺癌患者的基因表达谱。相关散点图显示,UbcH5c的表达与细胞增殖相关基因ki-67、PCNA、抗凋亡相关基因Bcl2、Bcl-xl以及emt相关基因Vimentin、N-Cadherin的表达呈正相关(图1f)。值得注意的是,最近的研究表明,UbcH5c参与了数十种蛋白的泛素化,并调节了与细胞增殖、抗凋亡和转移相关的各种通路。


图1 UbcH5c(又名UBE2D3)在胰腺癌中高表达,且与胰腺癌患者的不良预后相关

2.一种新的小分子UbcH5c抑制剂的鉴定

为了鉴定UbcH5c的小分子抑制剂,以UbcH5c为底物,对内部天然产物文库进行了分子docking和基于结构的虚拟筛选试验,发现了一种名为2α,6α-diacetoxy-4β-hydroxy-11(13)-pseudoguaien-12,8α-olide (DHPO)的活性化合物(图2d)。分子docking结果表明,DHPO通过与Leu86和Arg90的氨基形成氢键来靶向UbcH5c(图2a,b, c)。为了进一步验证DHPO与UbcH5c的直接相互作用,通过表面等离子体共振实验评估了它们的结合亲和力。如图2e和f所示,我们观察到DHPO与UbcH5c蛋白的相互作用,平衡解离常数(KD)为3.75 × 10-5 m。在Panc1和SW1990细胞中,细胞热位移实验进一步证实了DHPO-UbcH5c的结合。western blot结果显示,在对照组中,UbcH5c在较低的温度下表达,随着温度的升高,UbcH5c表达消失。然而,加入DHPO后,在50℃时出现了一条较强的UbcH5c条带,即使温度升高到58℃,仍可检测到蛋白条带(图2g),这表明在Panc1和SW1990细胞中,DHPO均有效地与UbcH5c蛋白结合。


图2 DHPO直接靶向UbcH5c

3. DHPO在体外对胰腺癌细胞具有抗癌活性

为了检测DHPO对胰腺癌细胞活力的抑制作用,用不同浓度的DHPO处理CFPAC1、HPAC、BxPC3、Panc1、SW1990、Capan2、AsPC1等7种胰腺癌细胞株和正常胰腺细胞株HPNE 72 h。如图3a所示,DHPO呈浓度依赖性地显著抑制胰腺癌细胞株的生长。其对胰腺癌细胞株的细胞毒性(IC50 = 2.5 ~ 8.5 μM)明显高于正常胰腺细胞株HPNE (IC50 = 25 μM)。集落形成实验显示,DHPO显著降低了集落形成效率(图3b和c)。为了确定DHPO对细胞凋亡的影响,采用流式细胞术进行Annexin V-FITC双染实验。结果表明,DHPO以浓度依赖性的方式诱导胰腺癌细胞凋亡(图3d和e)。进一步进行划痕愈合实验和transwell侵袭实验,分别评估DHPO对胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响。如图3f和h所示,DHPO显著抑制了Panc1和SW1990细胞的迁移。同样,DHPO浓度依赖性地抑制了Panc1和SW1990细胞的侵袭(图3g和图i)。


图3 DHPO抑制胰腺癌细胞增殖、诱导凋亡、抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭

4.转录组分析显示TNF-α/NF-κB通路参与了DHPO的抗癌活性

为了研究DHPO抑制胰腺癌细胞增殖和迁移的分子机制,以二甲基亚砜(DMSO)处理作为对照,对DHPO处理后的Panc1细胞进行了RNA测序。事实上,主成分分析(PCA)表明,与对照相比,DHPO的主成分1 (PC1)和PC2发生了变化(图4a)。经初筛,共有527个基因被鉴定为差异表达基因。其中,DHPO组中有323个基因上调,204个基因下调(图4b)。为了深入了解下调基因对生物学过程影响的全局模式,我们进行了GO和KEGG分析。总之,结果显示DHPO处理后下调的基因主要涉及细胞周期、细胞分裂、细胞增殖、DNA修复、DNA复制等生物学过程或信号通路(图4c、d),进一步证实DHPO抑制Panc1细胞增殖,诱导细胞凋亡。为了更全面地了解DHPO与对照组相比所改变的通路,我们对下调基因进行了基因集富集分析(GSEA)。对于Hallmark基因集,富集结果表明,通过NF-κB的TNF-α信号通路在对照组中富集(图4e)。DHPO可能通过抑制TNF-α/NF-κB信号通路发挥抗肿瘤作用。转录组数据生成了TNF-α信号通路中通过NF-κB基因集的基因热图(图4f)。推测DHPO与UbcH5c的直接相互作用降低了IκBα的泛素化和降解,抑制了NF-κB的活化及其下游靶基因的表达。


图4 Panc1细胞的转录组鉴定出下调的通路

5.蛋白质组学分析进一步证实了DHPO的抗癌活性

为了进一步阐明DHPO抗癌的潜在机制,对DHPO处理和未处理的Panc1细胞进行了多重串联质谱标签(TMT)定量蛋白质组学研究。在所有样本中共鉴定和注释了5505条独特的多肽。PCA显示DHPO组的PC1和PC2与对照组相比发生了变化(图5a)。如图5b所示,检测dhpo处理组和未处理组Panc1细胞的差异表达蛋白。与对照组相比,DHPO处理后163个蛋白的表达水平发生了显著改变。其中15个蛋白表达下调,148个蛋白表达上调。为了全面了解差异表达蛋白的功能,使用Metascape]进行通路和蛋白相互作用富集和聚类分析。通路富集分析揭示了与凋亡信号通路调节、蛋白定位到细胞核、MYC活性通路、抗原呈递和RNA代谢相关的通路(图5c),表明DHPO对细胞增殖和细胞死亡的总体影响。接下来,我们使用分子复合物检测算法识别涉及通路的蛋白质-蛋白质相互作用簇,包括代谢和细胞对DNA损伤刺激的反应(图5d)。


图5 Panc1细胞的蛋白质组学显示富集的通路

6. DHPO可抑制TNF-α诱导的NF-κB通路活化

然后评估DHPO对TNF-α诱导的NF-κB通路活化的影响。如图6a所示,在TNF-α处理的Panc1和SW1990细胞中,DHPO浓度依赖性地抑制IκBα的磷酸化,稳定IκBα,并降低总NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65的水平。我们还发现,在TNF-α刺激后,DHPO显著降低了NF-κB p65的核转位(图6b)。为了深入了解在DHPO处理的Panc1和SW1990细胞中,NF-κ b驱动的转录活性降低的后果,进行了蛋白质印迹分析,并表明DHPO处理显著下调下游基因c-Myc(细胞周期的驱动因素)和Mcl-1(抗凋亡)的表达(图6c)。实时荧光定量pcr检测DHPO或DMSO处理后Panc1和SW1990细胞中TNF-α/NF-κB信号通路相关基因的表达。与对照组相比,DHPO处理引起所有检测的TNF-α/NF-κB信号通路相关基因的显著抑制(图6d和e)。


图6 DHPO通过抑制NF-κB通路抑制胰腺癌细胞生长和转移

7. UbcH5c在DHPO的抗癌活性中发挥重要作用

为了进一步研究DHPO与UbcH5c的结合是否具有抗癌活性,我们构建了慢病毒短发卡RNA (lenti-shRNA)载体来敲低(KD) UbcH5c在Panc1和SW1990细胞中的表达。与对照shRNA相比,UbcH5c shRNA显著沉默了UbcH5c的表达(图7a和b)。western blotting实验显示,UbcH5c KD特异性地阻断了DHPO诱导的IκBα去磷酸化和稳定,从而逆转了DHPO对Panc1和SW1990细胞中NF-κB p65磷酸化和活化的抑制作用(图7a和b)控制单元(图7c和d)。


图7 敲低UbcH5c可降低DHPO的抗癌活性

8.DHPO在体内可抑制原位胰腺肿瘤的生长和转移,且不引起明显的宿主毒性

为了研究DHPO在体内的抗癌效果,建立了胰腺癌Panc1和SW1990原位肿瘤模型,分别给予对照组和DHPO腹腔注射35 d和28 d,然后通过活体成像系统直接监测生物发光信号。结果显示,对照组肿瘤生长迅速,而接受DHPO治疗的组明显抑制了肿瘤生长(图8a和b)。如图8c和e所示,与对照组小鼠相比,在Panc1和SW1990原位肿瘤模型中,DHPO分别抑制了80.67%和78.74%的肿瘤生长。为了监测DHPO潜在的体内副作用,每3天测量体重。在平均体重方面没有显著差异(图8d和f),这表明DHPO在有效剂量下没有引起任何明显的宿主毒性。


图8 DHPO抑制体内原位胰腺肿瘤生长

我们进一步评估了DHPO在体内对胰腺肿瘤转移的影响。如图9a和图9b所示,DHPO治疗显著防止了Panc1和SW1990肿瘤转移至肝脏、腹膜和脾脏。与对照处理的小鼠相比,DHPO将携带原位Panc1肿瘤的小鼠的腹膜和肝转移发生率分别从7/9和6/9降至4/9和3/9(图9c),将携带原位SW1990肿瘤的小鼠的腹膜、肝和脾转移发生率分别从13/15、9/15和9/15降至8/16、6/16和4/16(图9d)。从小鼠身上获取重要器官,包括肝、肺、肾、脾、心和脑,进行组织学检查。DHPO处理组未发现这些器官的组织学变化,而对照组有肝和脾转移(图9e),这证实了DHPO在有效剂量下没有显著的宿主毒性。


图9 DHPO可抑制胰腺癌的体内转移

结论

在本研究中,证明了UbcH5c与胰腺癌的临床相关性,并鉴定了一种有效的UbcH5c抑制剂DHPO,该抑制剂通过抑制NF-κB信号通路在体外和体内胰腺癌细胞模型中显示出抗癌效果。综上所述,我们的研究结果为胰腺癌的治疗提供了一个新的和有前景的靶点,并为人类癌症的治疗提供了候选药物。


Qi S, Guan X, Zhang J, Yu D, Yu X, Li Q, Yin W, Cheng XD, Zhang W, Qin JJ. Targeting E2 ubiquitin-conjugating enzyme UbcH5c by small molecule inhibitor suppresses pancreatic cancer growth and metastasis. Mol Cancer. 2022 Mar 10;21(1):70. doi: 10.1186/s12943-022-01538-4.

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