Nature | 冯越团队建立噬菌体反防御“海绵蛋白”研究新范式

在微生物的世界里，细菌和噬菌体之间的斗争犹如一场没有硝烟的“军备竞赛”绵延至今，它们相互拮抗，在漫长的进化历程中不断演变。为了抵御噬菌体的侵染，细菌进化出多种抗噬菌体防御系统，如CRISPR-Cas系统、限制-修饰系统 (R-M) 等。随着研究的不断深入，越来越多的细菌防御系统被挖掘出来，有意思的是，多种防御系统均采用了信号分子介导的防御模式。如CBASS系统，其编码一种 cGAS/DncV 样核苷酸转移酶 （CD-NTase） ，该酶在噬菌体感染后产生环状二核苷酸 （CDN） 或环状三核苷酸 （CTN） ，传递给下游效应蛋白，以此诱导宿主休眠并阻止噬菌体复制【1】，被认为是真核生物cGAS-STING系统的原核起源。又如Thoeris系统，其编码两种蛋白ThsA和ThsB，由ThsB识别入侵的噬菌体并产生信号分子1′′-3′-gcADPR，该分子随即激活效应蛋白ThsA【2】，引发细菌流产感染。

面对细菌的这些防御手段，噬菌体“魔高一丈”，编码众多以Anti-CRISPR （Acr） 蛋白为代表的反防御蛋白【3】。近年来，北京化工大学冯越课题组陆续阐明了噬菌体七种Acr蛋白以及可同时抑制CRISPR-Cas和CBASS系统的Acb2蛋白的抑制机制。2023年2月，冯越团队与加州大学旧金山分校Joseph Bondy-Denomy团队首次报道Acb2作为“海绵蛋白”，通过吸附多种CDN信号分子发挥其作为CBASS系统广谱抑制剂的作用 （详见BioArt报道：） 。同年12月，两课题组进一步发现Acb2可通过两种不同的结合口袋吸附所有目前已知的CBASS以及III型CRISPR-Cas系统的信号分子，因此称其为“超级海绵” （详见BioArt报道：） 。与此同时，噬菌体抗Thoeris系统蛋白 （Thoeris-anti-defense, Tad） Tad1和Tad2同样被鉴定为海绵蛋白，可吸附Thoeris系统的信号分子1′′-3′-gcADPR以及1′′-2′-gcADPR【4,5】。基于Acb2蛋白的工作，冯越课题组大胆设想，同为海绵蛋白的Tad1、Tad2是否也具有吸附多种环状寡核苷酸的能力？

2024年10月30日，冯越课题组再次与Joseph Bondy-Denomy课题组合作，在Nature在线发表了题为Single phage proteins sequester signals from TIR and cGAS-like enzymes的研究论文，报道Tad1和Tad2均同样为具有两种不同的结合口袋的“超级海绵”，从而将目前发现的仅有的三个噬菌体海绵蛋白均统一为多结合口袋的“超级海绵”，建立了海绵蛋白研究的新范式。

冯越组首先通过体外生化实验对Tad1及Tad2结合其他多种环状寡核苷酸的能力进行验证，发现二者除了对1′′-2′-gcADPR/1′′-3′-gcADPR有结合作用外，还能结合多种环二或环三核苷酸。为了揭示Tad蛋白结合信号分子的机制，冯越组解析了Tad蛋白与多种环状寡核苷酸的复合物晶体结构。他们发现Tad1蛋白以六聚体形式存在，而不是之前报道的二聚体，Tad1像一个拥有两个“隔离舱”的“分子飞船”，能形成两个独立口袋隔离两个CTN，同时Tad1还使用与 gcADPR 分子相同的结合口袋隔离 CDN。而Tad2 则是一个四聚体，可同时与两个 CDN 和两个 gcADPR 分子结合（图1）。此外，冯越组通过定量分析Tad蛋白与环状寡核苷酸的结合亲和力，发现Tad1对于常见的CBASS防御系统信号分子如cA3、2′,3′-cGAMP，3′,3′-cGAMP等均有较强的结合亲和力，而Tad2并不结合CTNs，仅结合CDNs。更有意思的是，他们发现Tad2的一个homolog （HgmTad2） 对cGG的结合亲和力高达24 pM，是目前已报道的亲和力最强的cGG结合蛋白，也远高于目前报道的海绵蛋白对信号分子的亲和力。在细菌中，cGG是最广泛的 CDN，它像一个“关键枢纽”参与调节细菌生长和行为包括运动、毒力、生物膜形成和细胞周期进程等多个方面。HgmTad2是首个发现的靶向cGG的噬菌体反防御蛋白，有望为未来研究cGG相关的信号转导通路提供思路。随后，Bondy-Denomy课题组通过抗噬菌体实验验证了Tad蛋白具有抑制CBASS系统以及Thoeris系统的体内活性。

图1 CbTad1-cA3-1′′-3′-gcADPR及HgmTad2-cGG-1′′-3′-gcADPR结构展示

综上，该论文以及冯越课题组针对Acb2的系列工作证实了目前已知的仅有的三种海绵蛋白, Acb2，Tad1，Tad2均为具有多个结合位点隔离信号分子的“超级海绵”，这一发现暗示具有多个信号分子结合位点的反防御蛋白可能广泛存在，从而建立了噬菌体反防御“海绵蛋白”研究的新范式。

北京化工大学大学博士研究生李栋、中国科学院植物研究所肖裕、加州大学旧金山分校Iana Fedorova博士，北京化工大学博士研究生熊伟佳，北京化工大学硕士研究生王宇及北京化工大学博士毕业生刘茜为本文的共同第一作者，北京化工大学冯越教授与加州大学旧金山分校Joseph Bondy-Denomy教授为本文的共同通讯作者。

https://www.nature.com/articles/s41586-024-08122-4

冯越研究组一直致力于研究微生物与宿主免疫系统相互作用的分子机理，目前以通讯作者（含共同）身份在Nature（2篇）、Cell、Nat Chem Biol（3篇）、Mol Cell（3篇）、Nat Commun（2篇）等杂志发表论文多篇。课题组长期招收博士后及博硕士研究生，欢迎感兴趣的同学加入。

制版人：十一

参考文献

1. Cohen, D. et al. Cyclic GMP-AMP signalling protects bacteria against viral infection.Nature574, 691-695 (2019).

2. Ofir, G. et al. Antiviral activity of bacterial TIR domains via immune signalling molecules.Nature600, 116-120 (2021).

3. Gao, Z.Y. & Feng, Y. Bacteriophage strategies for overcoming host antiviral immunity.Frontiers in Microbiology14(2023).

4. Leavitt, A. et al. Viruses inhibit TIR gcADPR signalling to overcome bacterial defence.Nature611, 326–331 (2022).

5. Yirmiya, E. et al. Phages overcome bacterial immunity via diverse anti-defence proteins.Nature625(2024).

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