中科院1区if7+: 吉林大学揭示五味子多糖调节肠道菌-色氨酸代谢-AHR通路轴预防酒精相关性肝病

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导读

多糖是五味子的主要活性成分之一，已被证明具有多种生物活性。本文研究了五味子多糖（SCP）通过慢性喂养加急性乙醇灌胃对酒精相关性肝病（ALD）的预防作用及其潜在机制。结果表明，补充SCP可以通过调节肠道微生物群和色氨酸（Trp）代谢来预防ALD。SCP显著富集肠道乳杆菌，尤其是罗伊氏乳杆菌，恢复了肠道吲哚衍生物（TRM、IAA、ILA、IALD）的含量，这些衍生物可以激活芳香烃受体（AHR），增加结肠AHR通路活性，修复肠道屏障损伤，减少循环脂多糖（LPS），抑制肝脏炎症、氧化应激和脂质积累。本研究利用体外色氨酸代谢能力筛选出一株罗伊氏乳杆菌，其体外增殖同样受到SCP的促进。灌胃罗伊氏乳杆菌增加了小鼠肠道TRM含量。此外，其ALD预防作用与SCP一致，并依赖于结肠AHR途径。研究结果证实，SCP可能通过调控肠道微生物Trp代谢-AHR通路轴来预防ALD，这表明补充益生元SCP是预防ALD的有效方法。

亮点：

1. SCP可预防小鼠ALD。

2. SCP富集罗伊氏乳杆菌并调节宿主Trp代谢。

3. SCP在体外促进产AHR激动剂-罗伊氏乳杆菌的增殖。

4. 罗伊氏乳杆菌通过AHR途径预防ALD。

论文ID

原名：Schisandra chinensis polysaccharide prevents alcohol-associated liver disease in mice by modulating the gut microbiota-tryptophan metabolism-AHR pathway axis

译名：五味子多糖通过调节肠道菌群色氨酸代谢AHR通路轴预防小鼠酒精相关性肝病

期刊：International Journal of Biological Macromolecules

IF：7.7

发表时间：2024.10

通讯作者：相宏宇，Jun-Yan Xiang

通讯作者单位：吉林大学，利兹大学

实验设计

实验结果

1. SCP的特征

纯化SCP的特征表明，它主要含有89.55±1.04%的碳水化合物和9.50±0.61%的蛋白质（表S1）。傅里叶变换红外光谱分析表明，SCP具有多糖的典型特征（图1A）。SCP中主要单糖的HPLC分析表明，葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔百分比分别为77.80%、8.98%、4.10%和7.74%（图1B）。扫描电子显微镜显示，SCP表现出长层状结构和粗糙表面（图1C）。2D和3D原子力显微镜图像显示，SCP具有相对均匀和对称的分支侧链结构（图1D）。凝胶渗透色谱表明，SCP的平均分子量为1.18×105Da（图1E）。

图1 SCP的特征。（A）SCP的傅里叶变换红外光谱。（B）通过高效液相色谱法检测SCP的单糖组成；标准品1-11是：1.古洛糖醛酸；2.甘露糖醛酸；3.甘露糖；4.核糖；5.鼠李糖；6.半乳糖醛酸；7.葡萄糖；8.半乳糖胺；9.半乳糖；10.木糖；11.阿拉伯糖。（C）SCP微观形态的扫描电镜观察（500×，2000×）。（D）使用原子力显微镜观察SCP分子形态。（E）通过凝胶渗透色谱法测定SCP的分子量分布。

2. SCP减轻了酒精诱导的小鼠肝损伤、炎症和脂质积聚

我们使用慢性喂养加急性乙醇灌胃引起的ALD模型，探索了低、中、高剂量SCP对小鼠ALD的预防治疗作用（图2A）。我们之前的研究表明，五味子提取物在缓解酒精性肝病方面既安全又有效。在整个喂养期间，SCP对体重没有显著影响，表明其安全无毒（图2B）。与对照组相比，饮酒导致血清天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平、肝脏指数和丙二醛（MDA）含量显著升高，肝脏SOD活性显著降低，表明肝损伤。与AH组相比，施用三个剂量的SCP显著改善了肝脏指数、血清AST和ALT、肝脏SOD活性和MDA含量，其中高剂量SCP显示出最明显的预防作用（图2C-F）。

图2 SCP减轻了酒精诱导的小鼠肝损伤、炎症和脂质积聚。（A）动物实验设计。（B）体重；n=6–8.（C）肝脏指数；n=6–8。（D）血清AST和ALT水平；n=6–8.（E）肝脏SOD活性；n=6–8。（F）肝脏MDA水平；n=6–8。（G）肝脏Tlr4、Tnf-a和Nf-κb的mRNA表达；n=6–8。（H）肝脏p-NF-κB p65、NF-κBp65的蛋白质印迹分析的代表性图像。（I）Srebp-1c、Acc1和Fasn的肝脏mRNA表达；n=6–8。（J）肝脏TG含量；n=6–8。（K）肝脏H&E染色的代表性图像（400×）。结果显示为平均值±标准差，不同字母表示组间存在显著差异（p<0.05）。

饮酒诱导的肝脏炎症和SCP显著降低了酒精升高的肝脏炎症因子，包括toll样受体4（Tlr4）、肿瘤坏死因子α（Tnf-a）和核因子κB（Nf-κB）mRNA表达水平（图2G）。免疫印迹分析表明，高剂量SCP抑制了肝脏中NF-κB p65的磷酸化（图2H）。此外，酒精干扰了肝脏脂质代谢，与AH组相比，SCP（尤其是高剂量）显著降低了肝脏甾醇调节元件结合蛋白1C（Srebp-1C）、乙酰辅酶A羧化酶1（Acc1）和脂肪酸合酶（Fasn）的过表达（图2I）。组织病理学分析显示，AH组肝脏脂肪空泡化和炎性细胞浸润增加。然而，SCP显著改善了这种病理（图2K）并降低了肝脏TG含量（图2J）。这些结果表明，预防性补充SCP可有效预防酒精诱导的小鼠肝损伤、氧化应激、炎症和脂质积聚。

3. SCP减轻了酒精引起的肠道损伤，并激活了结肠AHR通路

酒精暴露会损害肠道屏障的多层防御机制，与之前的研究一致，与CON组相比，AH组表现出回肠绒毛缩短和黏液层萎缩（图3A），紧密连接蛋白ZO1和OCCLUDIN的mRNA和蛋白质水平显著降低（图S1A、B），血清LPS水平升高，促炎细胞因子Tlr4、Tnf-α和Nf-κb的mRNA水平升高（图3B、C）。三种剂量的SCP恢复了肠绒毛长度和黏液层厚度（Fig.3A）。与AH组相比，高剂量SCP最显著地增加了回肠紧密连接蛋白的表达，包括Zo1和Occludin（图S1A，B），并降低了Tlr4、Tnf-a、Nf-κB和血清LPS水平（图3B，C）。这些结果表明，SCP可能有效缓解酒精引起的肠屏障损伤、肠道炎症和内毒素血症。

图3 SCP减轻了酒精引起的肠道损伤，并激活了结肠AHR通路。（A）回肠H&E染色的代表性图像（400×）。（B）血清LPS水平；n=6–8。（C）回肠Tlr4、Tnf-a和Nf-κb的mRNA表达；n=6–8。（D）AHR通路。（E）Ahr、Cyp1a1和Ahrr的结肠mRNA表达；n=6–8。（F）Zo1和Occludin的结肠mRNA表达；n=6–8。（G）结肠AHR免疫荧光染色和相对定量分析的代表性图像；n=3–4。（H）结肠ZO1、OCCLUDIN免疫组织化学染色和相对定量分析的代表性图像；n=3–4。结果显示为平均值±标准差，不同字母表示组间存在显著差异（p<0.05）。

我们检测了SCP对肠道AHR通路活性的影响，以探讨SCP对肠道损伤的保护机制。AHR在肠上皮细胞中的主要效应物包括细胞色素P450家族1亚家族A多肽1（CYP1A1）、白细胞介素22（IL22）、紧密连接蛋白（ZO1、OCCLUDIN）和AHR抑制剂（AHRR）（图3D）。与CON组相比，酒精特异性地显著降低了结肠Ahr、Cyp1a1、Ahrr、Zo1和Occludin mRNA水平（图3E、F），而在所有组中，酒精对肝脏和回肠Ahr和Ahrr没有显著影响（图S1C、D）。这表明酒精可能通过抑制结肠AHR通路活性导致肠道损伤。与AH组相比，SCPH组上述基因的表达水平显著升高。此外，免疫荧光和免疫组织化学染色表明，高剂量SCP显著恢复了酒精耗竭的结肠AHR、ZO1和OCCLUDIN蛋白表达（图3G，H）。这些结果表明，SCP通过恢复结肠AHR通路活性来缓解酒精诱导的肠道炎症和屏障损伤。

4. SCP调节ALD小鼠肠道微生物群组成

肠道微生物已被确定为特定的AHR配体产生者，提供了相对均匀的AHR刺激源。为了阐明SCP预防ALD的机制，我们使用16S rRNA测序研究了高剂量SCP对小鼠肠道微生物群的影响。主坐标分析表明，AH组小鼠的肠道微生物群组成与健康小鼠的肠道菌群组成存在显著差异，而SCP给药使肠道微生物群的组成恢复到与CON组相似的状态（图4A）。此外，SCP恢复了酒精降低的Shannon和Simpson指数，尽管两组之间没有观察到显著差异（图4B，C），表明其在恢复酒精降低的肠道菌群多样性和同质性方面的有效性。LDA显示，AH组的属水平特征细菌是肠球菌、Dubosiella、mle1-7、乳球菌、Opitutus和Enterorhabdus，而SCPH组的特征菌是乳杆菌、UGC-010和Roseburia（图4d）。其中，乳杆菌、肠球菌和Dubosiella是十大主要肠道细菌（图4E）。SCP显著降低了酒精含量，增加了肠球菌和Dubosiella的丰度，增加了乳杆菌的丰度（图4F）。此外，SCPH在乳杆菌属的物种水平上特别增加了Lactobacillus pontis和罗伊氏乳杆菌的相对丰度（图4G）。总体而言，SCP保护了被酒精破坏的肠道微生物群稳态，并特别富集了罗伊氏乳杆菌。

图4SCP调节肠道微生物和富集的乳杆菌。（A）回肠微生物群的主坐标分析。（B-C）Shannon（A）和Simpson（B）指数；n=3–4。（D）线性判别分析（LDA），LDA得分>3；n=3–4。（E）属水平前10种微生物的组成；n=3–4。（F）乳杆菌、肠球菌和Dubosiella的相对丰度；n=3–4。（G）乳杆菌物种相对丰度的热图；n=3–4。结果以平均值SD表示，不同字母表示组间存在显著差异（p<0.05）。

5. SCP恢复肠道Trp代谢产物，促进罗伊氏乳杆菌增殖

肠道微生物群，特别是乳杆菌，广泛表达将色氨酸代谢为吲哚衍生物的酶，吲哚衍生物随后激活AHR（图5A）。由于结肠AHR通路的激活和SCP对肠道乳杆菌的显著富集，我们基于Trp代谢通路从而分析CON、乙醇（AH）和SCPH组结肠内容物的代谢产物。偏最小二乘判别分析和代谢物热图显示，各组之间的Trp代谢物含量存在显著差异，特别是吲哚衍生物（图5B，S2A）。结果表明，与CON组相比，AH组的典型AHR激动剂（色胺(TRM)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚3-乙酸(ILA)和吲哚3-乙醛(IALD)）显著减少，SCPH组有效恢复（图5C-F）。此外，与AH组相比，SCP增加了肠道Trp水平，但不影响5-羟色氨酸（5-HTP）或犬尿氨酸（Kyn）水平（图S2B-D）。总之，SCP逆转了酒精诱导的肠道总AHR激动剂浓度的降低（图5G）。此外，TRM、IAA、ILA和IALD增强了Caco-2细胞中OCCLUDIN和CYP1A1的表达（图S3A、B），表明补充SCP可以促进肠道Trp代谢为吲哚衍生物，从而激活AHR通路。

图5 SCP恢复肠道Trp代谢产物，促进罗伊氏乳杆菌增殖。（A）色氨酸吲哚代谢途径。（B）结肠内容物中色氨酸代谢物的偏最小二乘判别分析。（C-F）结肠吲哚衍生物（TRM（C）、ILA（D）、IALD（E）、IAA（F））的含量；n=3–4。（G）AHR激动剂的总含量；n=3–4。（H）七种乳杆菌的体外吲哚衍生物生产能力。（I）qPCR法测定罗伊氏乳杆菌和干酪乳杆菌在体内的相对丰度；n=3–4。（J）罗伊氏乳杆菌体外生长曲线；n=3–4。结果显示为平均值±标准差，显著差异用*表示，不同字母表示组间显著差异（p<0.05）。

为了鉴定对SCP有反应并影响小鼠Trp代谢的关键乳杆菌物种，我们从之前的研究中收集了七种具有Trp代谢潜力的乳杆菌菌株，并与Trp一起培养，据报道，SCP恢复的罗伊氏乳杆菌是一种典型的AHR激动剂生产者。在这些菌株中，罗伊氏乳杆菌和干酪乳杆菌表现出很强的吲哚衍生物生产能力，罗伊氏乳杆菌的生产能力最高（图5H）。特异性引物同样证实SCP显著富集了罗伊氏乳杆菌，这与16S rRNA测序结果一致（图5I）。此外，SCP促进了细菌的体外增殖（图5J）。这些发现表明，罗伊氏乳杆菌可能是调节宿主Trp代谢以响应SCP的关键肠道益生菌。

6. 罗伊氏乳杆菌在定植后通过AHR途径缓解ALD

进行以下实验以验证罗伊氏乳杆菌介导SCP的ALD保护功效。CH-223191用于阻断AHR通路，并验证罗伊氏乳杆菌的肝保护机制与AHR通路有关（图6A）。微生物组的主坐标分析表明，L和L+C组的肠道微生物组组成与AH组非常相似；然而，所有三组与CON组都有显著差异（图6B）。与AH组相比，罗伊氏乳杆菌灌胃显著增加了乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的相对丰度（图S4A、6D），但对其他前10个优势属没有显著影响（图S4B-G）。与SCP相比，罗伊氏乳杆菌不抑制肠球菌。罗伊氏乳杆菌和CH-223191联合给药显著降低了阿克曼菌的相对丰度，增加了肠球菌丰度（图S4B，C）。这些结果表明，罗伊氏乳杆菌可以在小鼠肠道定植，对主要肠道细菌的丰度没有显著影响。

图6 罗伊氏乳杆菌灌胃后定植。（A）动物实验设计。（B）回肠微生物群的主坐标分析。（C）属水平前10种微生物的组成；n=3–4。（D）qPCR法测定罗伊氏乳杆菌体内相对丰度；n=3–4。结果显示为平均值±标准差，不同字母表示组间存在显著差异（p<0.05）。

进一步的研究表明，与SCP相似，与AH组相比，罗伊氏乳杆菌给药显著降低了异常的肝脏指数和血清ALT、AST和LPS水平（图7A、B、D），并有效缓解了肝脏脂质积聚和炎症浸润（图7C）。然而，伴随CH-223191给药消除了这些治疗作用。此外，与AH组相比，罗伊氏乳杆菌灌胃显著增加了结肠Ahr、Ahrr、Cyp1a1、Zo1和Occludin的表达（图7E、S5）。免疫荧光染色和蛋白质印迹分析表明，罗伊氏乳杆菌也显著增加了结肠AHR、IL22和CYP1A1蛋白的表达，表明罗伊氏乳杆菌强烈激活了结肠AHR通路，这种激活被CH-223191显著阻断（图7E-G）。这些结果表明，罗伊氏乳杆菌的ALD缓解作用取决于结肠AHR通路。

图7 罗伊氏乳杆菌依赖结肠AHR途径缓解ALD。（A）肝脏指数；n=6–8。（B）血清AST和ALT水平；n=6–8。（C）肝脏H&E染色代表图（400×）。（D）血清LPS水平；n=6–8。（E）Ahr、Ahrr和Cyp1a1的结肠mRNA表达；n=6–8。（F）结肠AHR、IL22免疫荧光染色和相对定量分析的代表性图像；n=3–4。（G）结肠CYP1A1的蛋白质印迹分析的代表性图像。（H）采用高效液相色谱法测定结肠内容物中TRM的相对含量；n=3–4。结果显示为平均值±标准差，不同字母表示组间存在显著差异（p<0.05）。

为了确定罗伊氏乳杆菌对宿主色氨酸代谢的影响，我们使用HPLC定量各组结肠内容物中吲哚衍生物的相对含量。只有罗伊氏乳杆菌灌胃后TRM显著增加，L组和L+C组之间没有明显差异（图7H）。这些结果提供了进一步的证据，表明罗伊氏乳杆菌在肠道定植可能通过促进色氨酸转化为TRM来激活结肠AHR通路。L+C组肝保护作用的抑制可归因于CH-223191阻断TRM激活的AHR通路。

在这项研究中，我们系统地评估了SCP对ALD的预防作用，并使用微生物组学和代谢组学研究了其机制。结果强调，肠道微生物群介导了SCP的有益作用。

酒精在摄入后主要在肝脏中代谢，破坏肝细胞膜的通透性，导致血清ALT和AST水平升高，这是重要的肝损伤指标。我们的结果表明，SCP显著降低了肝脏AST和ALT水平。五味子多糖可以调节肝脏氧化应激和脂质代谢紊乱。同样，在本研究中，SCP显著降低了肝脏MDA含量，增加了SOD活性，减轻了肝脏氧化损伤。此外，酒精会破坏肝脏脂质代谢，诱导肝脏脂肪堆积，这是酒精性肝病的病理特征之一。我们的结果表明，SCP显著抑制了肝脏Srebp-1c、Acc1和Fasn的表达，恢复了肝脏指数和TG含量。上述结果充分证明，SCP能有效缓解ALD相关症状。

肝脏和肠道之间以肠-肝轴的形式存在密切联系。部分未代谢的酒精被肠道吸收，破坏肠道屏障的多层防御，导致有害微生物产物转移到肝脏，这是肝损伤的关键致病因素。SCP有效地恢复了酒精诱导的肠道病理损伤，并显著抑制了Tlr4、Tnf-a和Nf-κb等肠道和肝脏炎症因子的表达，上述有益作用可能是由于SCP通过修复肠道屏障的完整性降低了循环LPS水平。肠屏障功能受各种信号调节，如G蛋白偶联受体（GPCR）、TLR、法尼醇X受体（FXR）和AHR，AHR在屏障组织内的免疫细胞、上皮细胞、内皮细胞和基质细胞中广泛表达，它能感知多种肠道信号，增强屏障功能，控制肠道炎症，维持肠道屏障稳态。最近的研究表明，酒精摄入会影响肠道AHR通路的活性，AHR途径的激活有助于缓解ALD。因此，我们特别关注酒精和SCP对AHR通路的影响。与该报告一致，酒精显著抑制了结肠AHR通路的活性，并抑制了肠道紧密连接蛋白的表达。SCP显著增加了结肠Ahr、Ahrr、Cyp1a1以及肠紧密连接蛋白ZO1和Occludin的表达水平。这些发现表明，SCP通过激活AHR通路修复了肠屏障损伤。尽管肝脏AHR信号传导也被证明有助于减轻肝脏氧化损伤和纤维化，但在这项研究中，酒精和SCP均未影响肝脏和回肠AHR活性。

除了酒精对肝实质细胞的直接毒性作用外，微生物群异常也是ALD的重要因素。了解宿主和肠道微生物群之间的沟通机制可以促进各种疾病的治疗策略的发展。我们的结果表明，SCP具有相对均匀和对称的分支侧链结构。这种结构可能使其更难被胃肠道消化，从而增强其靶向肠道微生物群的有效性，这表明SCP有潜力被开发为肠道益生元补充剂。益生元多糖已被证明可以通过影响肠道微生物群稳态来缓解多种与肝脏相关的疾病。例如，据报道，栀子多糖给药可以调节肠道菌群失调，改善胆汁淤积性肝损伤。此外，核桃青皮多糖已被证明可以改变肠道菌群，减轻赭曲霉毒素A诱导的小鼠肝脏炎症。这些发现与我们的研究结果一致，即SCP保护了小鼠酒精紊乱的肠道微生物群。具体而言，SCP显著增加了乳杆菌的丰度，同时减少了肠球菌和Dubosiella的丰度。肠球菌可引起肝脏炎症，加重酒精性肝损伤；高脂饮食诱导的肠道疾病中会富集Dubosiella。此外，饮食中摄入晚期糖基化终末产物已被证明可以富集肠道Dubosiella并促进组织炎症。Spearman相关性分析表明，SCP抑制的Escherichia-Shigella、肠球菌和Dubosiella与肝损伤相关指标呈正相关，与肠道紧密连接蛋白和AHR通路呈负相关。SCP促进的细菌，特别是乳杆菌，与肠屏障蛋白和AHR途径呈正相关，与肝损伤指标呈负相关（图S6）。这些结果表明，SCP至少部分减轻了酒精对肠道微生物群组成的不利影响，这种调节作用有助于减轻ALD。

最近的研究证实，乳杆菌表达各种酶，将色氨酸代谢为吲哚衍生物，许多吲哚衍生物已被鉴定为内源性AHR激动剂。因此，我们采用靶向代谢组学来研究SCP对肠道Trp代谢物的影响。SCP丰富肠道乳杆菌，恢复肠道吲哚衍生物水平，特别是那些激活AHR的吲哚衍生物。此外，与AH组相比，SCP降低了肠道Kyn和5-HTP水平，这可能是由于SCP调节肠道微生物群，使宿主Trp代谢的平衡更多地转向细菌代谢。重要的是，补充SCP会显著增加罗伊氏乳杆菌的肠道数量，而酒精会减少罗伊氏乳杆菌的肠道数量。在体外培养的具有代谢色氨酸潜力的各种乳杆菌物种中，罗伊氏乳杆菌表现出最广泛的吲哚衍生物生产能力，可以刺激AHR，这与该领域之前的预测一致。此外，SCP显著促进了其体外增殖，表明罗伊氏乳杆菌相关的Trp代谢可能是使用SCP预防ALD的关键因素。

据报道，罗伊氏乳杆菌通过不同机制缓解肝脏免疫损伤、肝细胞癌、肝细胞凋亡和化学性肝损伤。本研究主要关注其对小鼠ALD和Trp代谢的影响。罗伊氏乳杆菌在灌胃成功定植后，对ALD的预防作用与SCP相同。此外，罗伊氏乳杆菌与AHR抑制剂CH-223191的联合给药表明，这些治疗效果取决于结肠AHR途径。与之前的报道相反，罗伊氏乳杆菌没有显著调节受酒精摄入显著影响的主要肠道微生物。特别是，当与CH-223191联合给药时，它会富集肠球菌，这可能会加重肝损伤。这一结果表明，罗伊氏乳杆菌可能主要通过结肠AHR途径发挥其有益作用。补充罗伊氏乳杆菌后，几种吲哚衍生物在自身免疫性疾病中显示出增加的趋势，这与我们的研究一致，其中L组肠道TRM的相对含量显著高于CON和AH组。尽管没有检测到其他吲哚衍生物，但这些结果提供了进一步的证据，表明SCP可能通过罗伊氏乳杆菌和AHR途径发挥ALD预防作用。在这项研究中，我们没有排除肠道菌群对宿主色氨酸代谢的影响。未来的研究可以利用无菌小鼠来研究这些肠道微生物是否调节ALD模型中SCP介导的有益代谢。

结论

总之，我们证实，SCP通过促进有益肠道细菌罗伊氏乳杆菌的增殖、增加肠道吲哚代谢物的含量、增强结肠AHR通路活性、修复ALD中受损的肠道屏障和降低循环内毒素水平，有效缓解酒精诱导的肝脏炎症、脂质积聚和氧化应激。SCP对ALD的保护机制依赖于肠道微生物群Trp代谢AHR通路轴。我们的研究结果为使用靶向肠道微生物群的SCP预防ALD策略提供了理论依据。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813024076529

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