专家点评Immunity丨张惠媛/胡洪波/刘新东揭示HIF2α通过调控磷脂代谢促进干性样Th2向致病性Th2分化

过敏性哮喘是一类主要由异常活化的辅助2型T细胞（T helper 2,Th2） 引起的II型免疫应答。全球有超过3亿人被哮喘所困扰，尤其是发达地区的发病率呈现出逐年上涨【1】。哮喘患者在吸入过敏原后会迅速激活大量Th2细胞，产生高气道反应（Airway hyperresponsiveness,AHR）【2】。尽管发作后及时给予支气管扩张剂和糖皮质激素等药物的干预能有效改善症状，但始终无法根治；而且部分重症患者出现激素不敏感甚至耐药，严重影响预后。此外，现有的细胞因子单抗疗法也存在疗效有限和病情易反复等局限性，因此如何靶向介导哮喘病理反应的核心细胞进行精准治疗，依旧存在挑战。

近年来的多项研究报道了人和小鼠均存在致病性Th2细胞，该亚群上调多种细胞因子和受体，可诱导嗜酸性粒细胞重编程，促进肺部纤维化病变【3, 4】。但这群细胞是如何被诱导产生，关键调控分子机制是什么？以及Th2中是否还存在发挥其他功能的亚群？如何精准靶向Th2亚群细胞进行哮喘等II型免疫疾病等治疗等目前尚未可知。因此，深入研究哮喘中Th2细胞的基因表达特征及功能，对于理解致病性Th2的分化和功能调控至关重要。同时，寻找致病性Th2细胞的命运调控机制，对开发靶向Th2的哮喘治疗新策略具有启发意义。

2024年11月27日，四川大学张惠媛教授、胡洪波研究员团队联合陆军军医大学刘新东教授，在Immunity杂志上发表了题为Hypoxia-inducible factor 2α promotes pathogenic polarization of stem-like Th2 cells via modulation of phospholipid metabolism的文章。研究团队发现了缺氧诱导因子Hypoxia-inducible factor 2α （HIF2α） 在人和小鼠的致病性Th2细胞均特异性高表达。T细胞特异性敲除HIF2α可显著减少Th2分化并抑制其功能，从而明显改善小鼠哮喘模型肺部炎症表现。结合单细胞测序、TCR测序和CUT&Tag等多组学分析和体内过继实验，该研究进一步揭示了HIF2α调控TCF1+Ly108+干性样Th2向ST2+CD25+致病性Th2细胞的分化的核心机制。HIF2α协同Th2关键转录因子GATA3，共同调控下游肌醇磷酸激酶IPMK，进而调控磷脂代谢和活化TCR-PI3K-AKT信号通路，促进致病性Th2的分化。更为重要的，HIF2α小分子抑制剂也可以明显减轻小鼠哮喘表型，抑制致病性Th2功能和分化。

研究人员首先整合分析了已发表的人哮喘和慢性鼻窦炎患者 （伴有进行性哮喘或哮喘病史） 以及小鼠哮喘模型的单细胞测序数据，发现Epas1 （HIF2α的编码基因） 在一类高表达致病性特征的Th2亚群中特异性上调，并且与上述基因的表达水平正相关。进而通过构建T细胞条件性缺失HIF2α的CD4Cre+ Epas1f/f小鼠 （简称HIF2α TKO，下同） ，研究人员发现HIF2α缺失不仅直接抑制Th2细胞分化，而且显著减轻小鼠哮喘模型炎症表型，降低IL-4，IL-5，IL-13和IgE的分泌水平。在此基础上，研究者利用嵌合体模型，将野生型 （简称 WT，下同） 和HIF2α TKO来源的骨髓细胞等量混合，重建受体小鼠后再次建立哮喘模型，结果揭示了HIF2α调控Th2分化和功能是细胞内机制，而不是由于不同基因背景造成的炎性环境的差异所致。此外，研究者也比较了HIF2α-，HIF1α-与HIF1/2 α-双缺失小鼠对于OVA诱导哮喘应答和Th2分化的差异，发现相较于HIF2α，HIF1α对于Th2分化和功能均是冗余的。前期研究揭示，HIF1α主要促进Th17的分化，并通过介导FOXP3降解抑制Treg的产生。上述结果提示，不同的HIF分子对T辅助细胞的调节机制各有差异。

鉴于Th2细胞存在异质性群体，为了探索HIF2α如何在单细胞水平层面调控不同Th2亚群的分化和功能，研究者分选了WT和HIF2α TKO哮喘模型小鼠的肺泡灌洗液细胞 （全称，BALF） ，颈部浅表淋巴结 （Superficial Cervical Lymph Nodes, sLN） 和脾脏等多种组织中的CD4+T细胞，进行单细胞转录组 （scRNAseq） ，单细胞TCR组测序 （scTCRseq） 和结合细胞表面蛋白和转录组的单细胞测序 （Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing, CITEseq） 。单细胞转录组的分析结果表明，BALF， sLN和脾脏中Th2细胞均分为6个细胞亚群。其中C1高表达性Gata3，Epas1，Il1rl1，Il2ra和Pparg等广泛证实的致病Th2细胞的特征基因；C2细胞高表达Ikzf2，Ccr2，Ccr5和Foxp3等基因；而C0则上调Slamf6和Tcf7等干细胞样特征基因，提示Th2细胞的普遍存在异质性。

HIF2α缺失致使C1比例下降，而C2比例增加，提示二者可能存在分化/发育相关性。为了推断不同Th2亚群的发育轨迹，研究者首先利用scTCRseq数据对TCR克隆型进行分析。C0较其它5个亚群具有更高的克隆多样性，提示其处于分化早期；并且C0与C1至C4亚群克隆型高度相似，提示这五个亚群可能处于共同的分化路径中。为了探究上述亚群分化轨迹，研究者以初始CD4+T细胞作为起始点，应用Monocle3工具对细胞进行了伪时间排序，重建了从C0到C4的分化轨迹。轨迹推断显示干细胞样Th2细胞 （C0） 自初始CD4+T细胞发育而来，在C3和C4之间分成两个分支，最终分化为致病性Th2细胞 （C1） 和Ikzf2+Th2细胞 （C2） 。将WT和HIF2α TKO细胞沿轨迹分布进行投射，显示WT细胞更多分化为致病性Th2细胞，而HIF2α缺失细胞则向Ikzf2+Th2细胞分化。在此基础上，结合CITEseq和qPCR验证等，研究者将CD45+CD11b-CD4+CXCR6+CD25+ST2+的细胞定义为致病性Th2细胞，CD45+CD11b-CD4+CXCR6+ST2-CD25-Ly108+的细胞定义为干细胞样Th2细胞，CD45+CD11b-CD4+CXCR6+ST2-CD25-Ly108-CD27+CCR5+的细胞定义为Ikzf2+Th2细胞。

接下来研究者通过体外分化和体内移植实验，进一步验证HIF2α缺失不仅显著减少了干细胞样Th2细胞向致病性Th2细胞的分化，还会导致干细胞样Th2细胞增殖能力显著下降，提示该分子同时调控干细胞样Th2的分化和功能。更为重要的是，研究者分别比较了抗原特异性WT和HIF2α缺失致病性Th2细胞的致病能力，发现过继了HIF2α缺失致病性Th2的Rag1-/-小鼠对OVA的诱导无应答，肺部也没有哮喘相关炎症表现，提示HIF2α对调控致病性Th2细胞功能同样不可或缺。

分化轨迹分析提示从干细胞样Th2向致病性Th2分化过程中，磷脂酰肌醇介导的PI3K-AKT通路显著上调，而在HIF2α缺失细胞中受到抑制。提示HIF2α可能通过调控磷脂代谢，进而活化TCR-PI3K-AKT信号通路，促进致病性Th2分化。通过脂质测序，研究者发现与干细胞样Th2相比，致病性Th2显著增加了磷脂酰肌醇的代谢产物，而HIF2α缺失的干细胞样Th2和致病性Th2细胞上述代谢物均明显降低，提示HIF2α缺失可能导致磷脂磷脂酰肌醇产物减少，进而降低PI3K-AKT活化。

为了验证这一科学假说，研究者首先比较了WT和HIF2α缺失T细胞在TCR刺激下，AKT以及下游磷酸化产物的活化情况。结果显示，HIF2α缺失T细胞的AKT，FOXO，S6K等磷酸化水平均显著下调。为了探究HIF2α是如何调控磷脂代谢的，研究者首先探讨了HIF2α在Th2分化过程中受到哪些因子的调控。研究结果揭示IL-4通过诱导Th2细胞分化的关键转录因子GATA3，直接转录调控HIF2α。非常有趣的是，GATA3在Th2中的表达，也同时受到HIF2α的直接转录调控，两个转录因子形成信号环路。与之相吻合，从发育轨迹的投射来看，从干细胞样Th2到致病性Th2分化过程中，GATA3和HIF2α同步上调，提示二者可能协同诱导致病性Th2的产生。

为了进一步揭示GATA3和HIF2α调控的分子机制，研究者分别利用WT和HIF2α缺失的干细胞样Th2，或者致病性Th2细胞，进行了GATA3和HIF2α的CUT&Tag测序和数据整合分析。结果表明HIF2α和GATA3协同调控了多个在致病性Th2上调的基因，包括Il1rl1和Pparg等致病性基因。更为重要的是，二者协同调控TCR活化和磷脂代谢。其中研究者发现编码肌醇磷酸激酶的IPMK同时受HIF2α和GATA3的直接转录调控。IPMK催化PIP2生成PIP3，进而活化AKT以及下游通路，其表达水平在HIF2α缺失的致病性Th2中显著降低。进一步，研究者验证了在HIF2α缺失naïve CD4+ T细胞中过表达IPMK，不仅能回补PIP3含量，增加AKT以及下游分子的活化，而且可以逆转致病性Th2分化的减少。综上，提示HIF2α-GATA3环路通过直接调控磷脂代谢，促进TCR-PI3K-AKT活化，促进了干细胞样Th2到致病性Th2的分化。值得一提的是，相较于其他T辅助细胞，Th2的分化更加依赖与IPMK-AKT的活化，表现为产生更多的IPMK+pAKT+细胞，在一定程度上也与IL-4诱导HIF2α和GATA3表达增加，并形成信号环路相吻合。

为评估靶向HIF2α的干预措施在哮喘治疗中的应用潜力，研究者利用HIF2α特异的小分子抑制剂PT-2385进行体内外实验。该抑制剂靶向HIF2α的PASB结构域，特异性抑制HIF2α的转录活性。结果表明PT-2385可以特异性抑制Th2细胞的体外分化，并且在PT-2385治疗的哮喘小鼠中，Th2细胞和嗜酸性粒细胞比例较对照组显著降低，此外，BALF中IL-4，IL-5和IL-13的含量也显著减少，有效缓解了炎症症状。为进一步探究全身性抑制HIF2α治疗哮喘的细胞和分子机制，研究者分选了BALF中的细胞进行了单细胞转录组测序。结果发现通过抑制HIF2α的转录活性，同样可以特异性抑制致病性Th2细胞的分化，减少嗜酸性粒细胞的招募，显著降低多种Th2亚群中II型免疫反应和PI3K活化相关通路的富集得分。

综上，这项工作发现了调控致病Th2细胞分化的靶点HIF2α（图1）。结合基因多组学分析，研究团队揭示了HIF2α与GATA3互作并共同调控磷脂代谢的机制——通过上调肌醇磷酸激酶IPMK进一步促进PI3K-AKT的信号激活，同时上调一系列致病性基因表达，引起干性样Th2向致病性Th2的分化。而对HIF2α抑制剂PT-2385的使用，为靶向Th2的哮喘治疗方案提供新的思路和可能性。

图1：HIF2α通过调控磷脂代谢促进致病性Th2分化的机制模式图

四川大学免疫与血液研究院/生物治疗全国重点实验室张惠媛教授和胡洪波研究员以及陆军军医大学/金凤实验室刘新东教授为该论文通讯作者。四川大学免疫与血液研究院/生物治疗全国重点实验室邹欣凯博士、王可玥博士、邓禹君博士和关鹏博助理实验师为该论文共同第一作者。四川大学第二医院周圣涛教授，华西医院质谱平台杜丹主任以及徐州医科大学王会教授为本研究提供了重要支持。

https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(24)00496-5

专家点评

周洁 教授

哮喘作为一种全球性高发疾病，因发病机制复杂且难以根治，长期困扰医学界。Th2细胞的过度活化，是哮喘的重要免疫病理机制。四川大学张惠媛、胡洪波教授团队和陆军军医大学刘新东教授通过深入研究Th2细胞的功能异质性，发现HIF2α是促进致病性Th2的关键分子，为Th2富集型哮喘的治疗策略提供了潜在靶点，同时填补了HIF2α在适应性免疫应答中的知识空缺。

该研究一方面创新性地发现HIF2α在Th2上特异性高表达和其对Th2分化的精细调控作用。另一方面结合单细胞转录组测序、TCR测序等多组学分析揭示了哮喘中Th2细胞的异质性，绘制了干性样Th2到致病性Th2的分化轨迹。机制研究表明：HIF2α能直接通过与Th2关键转录因子GATA3相互调控，促进致病性Th2细胞的分化。进一步结合CUT&Tag测序和脂代谢测序等，解析了HIF2α在哮喘发病过程中的核心作用：通过与GATA3协同促进磷脂代谢和PI3K-AKT信号通路激活，推动干性样Th2向致病性Th2的分化。

该研究不仅鉴定了哮喘发生过程中干性Th2及致病性Th2细胞的存在，促进了对哮喘中Th2功能异质性的理解，明确了HIF2α在哮喘中不可或缺的作用。此外，该团队还通过HIF2α抑制剂PT-2385在小鼠哮喘模型中的应用验证，表明抑制HIF2α可显著缓解哮喘。相比现有的细胞因子单抗疗法，HIF2α抑制剂通过调控Th2功能亚群，能够更精准抑制哮喘免疫病理过程，有望解决部分患者对IL-4、IL-5单抗的耐药性，以及GATA3难以靶向等哮喘治疗中面临的难题。

专家点评

李启靖 教授（新加坡科研局分子与细胞生物学研究院，新加坡免疫学研究所）

免疫学领域长期以来对CD4⁺效应性T细胞分化的认识，主要基于体外分化条件下形成的表型及其在体内外相似的炎性反应。尽管对其分化“成熟度”已有一定感性理解，但对分化过程的精细阶段性、尤其是在人类及动物组织中是否存在阶段性的“亚稳态”，了解仍相对有限。随着高通量测序技术的迅猛发展，T细胞异质性的复杂性逐渐显现，效应性T细胞在组织中分化的精密调控网络亟需进一步阐明。

针对这一科学问题，四川大学张惠媛、胡洪波教授团队与陆军军医大学刘新东教授团队合作，聚焦Th2细胞在体内的分化演变，为解析哮喘这一典型II型免疫疾病的病理机制提供了全景式视角。如同《笑傲江湖》中“一招包一路”的衡山五神剑，该研究通过整合单细胞转录组等多组学数据，从分子、细胞、代谢及亚群功能等多维视角，层层剖析。一剑既出，与哮喘相关的Th2细胞体内分化机制及其核心致病路径毕现。

近年来，多个研究表明，CD4⁺干细胞样T细胞的长期存在，是多种自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病难以根治的重要原因。该团队的研究首次发现了干细胞样Th2亚群，广泛存在于多种人II型免疫疾病及小鼠哮喘模型的炎性组织和外周淋巴器官（如淋巴结和脾脏）中。结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞TCR测序（scTCR-seq）及CITE-seq，该研究全面定义了Ly108⁺TCF1⁺干细胞样Th2细胞及其发育轨迹。通过体外分化实验及体内谱系追踪研究，团队进一步揭示了HIF2α在干细胞样Th2向致病性Th2分化中的关键作用，发现其不仅促进致病性Th2分化，还对维持干细胞样Th2细胞的增殖至关重要。本研究最精妙之处在于，这种干细胞样Th2细胞具有高度克隆多样性及多种分化潜能，其向致病性Th2和非致病性（Foxp3+）Th2细胞间的平衡，为理解Th2细胞在生理或病理环境中的动态表现提供了全新的研究框架。

研究成果深化了对哮喘中Th2细胞异质性及其功能的理解，并为从干细胞样Th2和致病性Th2的调控角度出发，解决II型免疫疾病提供了全新思路。同时，该团队评估了HIF2α小分子抑制剂PT-2385在哮喘治疗中的潜力。结果显示，PT-2385通过靶向HIF2α的转录活性，可有效抑制Th2细胞分化，并显著改善小鼠哮喘表型。这一成果为开发针对HIF2α的靶向治疗提供了直接证据，在哮喘等II型免疫疾病的治疗策略上具有重要的临床转化价值。

制版人：十一

参考文献

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2. Nur Husna, S.M., Tan, H.-T.T., Md Shukri, N., Mohd Ashari, N.S., and Wong, K.K. (2022). Allergic Rhinitis: A Clinical and Pathophysiological Overview.Front Med(Lausanne) 9, 874114. https://doi.org/10.3389/fmed.2022.874114.

3. Calise J, Garabatos N, Bajzik V, Farrington M, Robinson D, Jeong D, Londei M, Wambre E. Optimal human pathogenic T(H)2 cell effector function requires local epithelial cytokine signaling [J].J Allergy Clin Immunol, 2021, 148(3): 867-75 e4.

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