p53药物研发“深刻反思”

抑癌蛋白p53在约50%的癌症患者中发生突变，是生物医学历史上被研究最多的蛋白之一。过去25年，有至少71个p53突变体恢复剂被报道，相关临床试验超过20个，涉及1000多名癌症患者。然而，这些化合物在实验室中的活性大多数无法被检测到，在临床上尚未观察到统计学显著的患者获益。

上海交通大学医学院附属瑞金医院卢敏团队早期揭示了癌症中p53功能丧失的新机制 [1-3] ，近年来设计了p53功能恢复策略并揭示了结构学机制 [4] ，获得了唯一有效的p53恢复剂三氧化二砷（ATO） [5] ，之后首次在人体内（first-in-human）实现了p53突变体功能恢复 [6] 。

图片来源：Cancer Discovery

2024年11月1日，卢敏研究员为独立通讯作者，宋花歆、肖淑君、吴嘉祺为共同第一作者，在Cancer Discovery发表评述文章 [7] ，以“Drugging p53: Barriers, Criteria, and Prospects”为题提出了p53恢复剂的研究规范。文章重点讨论了p53恢复剂研究的科学逻辑，长期以来对p53突变体的误解，p53恢复剂的研发障碍、有效性评估标准、临床转化规范、经验教训以及未来前景。

在OncoKB数据库中收录的数百种明确的癌症驱动基因中，约一半编码肿瘤抑制因子（抑癌蛋白），四分之一编码癌蛋白。目前已有大量癌蛋白已经成药，而靶向抑癌蛋白的药物研发成果有限。开发p53恢复剂的科学挑战在于：用药物靶向抑癌蛋白需要恢复（而非常规地抑制）蛋白功能。如果用小分子结合至抑癌蛋白的活性位点，那么预计会是抑制（而非恢复）蛋白功能；如果用小分子结合至抑癌蛋白的非活性位点，这种结合又如何能实现蛋白功能恢复？这篇最新综述以p53作为抑癌蛋白的一个典型例子，剖析靶向抑癌蛋白所面临的困境。

（A）p53突变导致蛋白失去功能的多种机制（蓝色框）、研发p53恢复剂面临的4个障碍（粉色框）、p53恢复剂研究的经验教训和成药前景（黄色框）。下方灰色框依次列出4项领域内误区、恢复剂的有效性评估标准、将恢复剂推进至临床试验的规范。（图片来源：Cancer Discovery&卢敏团队）

唯一的科学策略：靶向蛋白折叠

p53主要通过与DNA结合并转录激活其下游的靶基因来发挥抑癌功能。癌症中至少存在数千种不同的p53突变，这些突变通过各种不同的机制削弱p53与DNA的结合能力，从而削弱其抑癌功能（图A，蓝色框）。

一些突变正好发生于p53的DNA结合氨基酸（通常是带正电的精氨酸），导致这些突变体无法结合DNA，从而失去抑癌功能，这一类突变体被称为“DNA结合型突变体”。迄今为止，尚不存在恢复p53“DNA结合型突变体”功能的可行策略。作为一个重要的转录因子，p53进化出的DNA结合氨基酸可以与DNA的大沟和小沟在形状、电荷、朝向上完美匹配。很难想象一个小分子可以在形状、电荷、朝向上弥补因突变而缺失的精氨酸，此外还可以消除因突变而出现的新氨基酸所带来的负面影响。 虽然已有研究报道某些化合物可以插入p53与DNA的结合面，但预期这些化合物只会削弱p53的DNA结合能力 。总体而言，DNA结合型突变体不太可能通过药物恢复功能，而只能通过基因工程手 段进行功能恢复，例如通过基因突变重新引入可以结合DNA的精氨酸。

（B）胶连蛋白内部的多个氨基酸的作用力，促进了蛋白折叠。这些作用力包括自发生成的作用力如疏水相互作用、氢键、二硫键等等，也包括小分子与口袋结合时导入的作用力。（图片来源：Cancer Discovery&卢敏团队）

另一些突变则发生于维持p53三级结构的氨基酸，导致p53不能折叠出三级结构，进而不能结合DNA并失去功能，这类突变被称为“结构型突变体”。蛋白质的折叠由“氨基酸胶水”（例如疏水作用、氢键、二硫键等）驱动，这些“氨基酸胶水”将蛋白内部的两个或多个氨基酸胶联在一起（图B）。在癌症中，造成p53内部空腔化的突变（如F270L和V143A等突变在p53内部从大尺寸氨基酸变成小尺寸氨基酸）和扰乱L2-L3结构的突变（如R175H、R249S和C242S等使L2和L3相互作用丢失的突变）都导致p53中某些关键“氨基酸胶水”的丢失，进而导致p53从折叠状态转变为非折叠状态。反过来，当一个小分子结合到某个蛋白内部的口袋中时，它通常会提高蛋白的热稳定性（亦即结构稳定性）和折叠能力（亦即蛋白复性），因为它在口袋中创造了新的“氨基酸胶水”，将蛋白内部的多个氨基酸胶连到一起（图B）。

卢敏团队将促进蛋白折叠并恢复蛋白功能的靶向策略取名为靶向蛋白折叠（Targeted Protein Folding，TPF），类比于已经得到广泛应用的靶向癌蛋白的靶向蛋白抑制（Targeted Protein Inhibition，TPI）和新兴的靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation，TPD）。据称，TPF是目前唯一具有科学逻辑的p53功能恢复策略，但该策略只适用于结构型p53突变体。

四大“误解”

关于p53突变体，有四个普遍存在的误解（图A，第一个灰色框），这些误解长期以来阻碍了领域发展。第一个常见的误解是相信存在一种“万能”p53恢复剂，可以恢复所有不同p53突变体的抑癌功能。然而，基于p53突变体多样的失活机制（图A，蓝色框），很容易得出结论：任何一个p53恢复剂，只可能适用于失活机制与该恢复剂的工作机制一致的p53突变体。 遗憾的是，当前许多基础研究仍然随意选择一个p53突变体进行研究。这种误解进一步导致临床医生在开展临床试验时，未对患者的p53突变类型进行分类。

第二个误解是认为可以通过传统的低温实验条件来评估结构型p53突变体的折叠情况。蛋白的折叠和不折叠状态由其熔解温度（Tm）决定。当环境温度（Tambient）高于蛋白的Tm时，蛋白会趋向不折叠，反之则趋向折叠。野生型p53的Tm值约为42°C，因此在人体中（37°C）趋向折叠状态。而结构型突变体由于缺失若干“氨基酸胶水”，Tm值通常在20–37°C之间，因而在人体中处于非折叠状态并失去功能。需要注意的是，这些结构型突变体的Tm值仍远高于4°C，这意味着它们在传统4°C实验条件（注：为防止抗体失活，一般涉及抗体的实验都在4℃下开展）下仍保持折叠状态，不能真实反映它们在人体内的非折叠状态。因此，评估结构型p53突变体折叠状态的实验（如特异性识别折叠p53的PAb1620抗体相关实验、特异性识别非折叠p53的PAb240抗体相关实验）应在室温或更高温度下开展，以准确反映其在体内的非折叠状态。

第三个误解是认为“用小分子修饰p53表面的一个半胱氨酸可以促进p53折叠（亦即可以提高p53的Tm值）”。如前文所述，蛋白的折叠主要由“氨基酸胶水”胶连蛋白内部的2个或多个氨基酸所驱动（图B）。这一概念得到了数百种临床阶段和获批小分子药物的支持——这些靶向小分子结合在靶蛋白内部的口袋，提供了“氨基酸胶水”，进而导致Tm值增加。然而，目前大量p53突变体恢复剂被设计通过修饰p53表面的单个半胱氨酸来起作用（图B）。目前还没有科学依据来解释这类修饰是如何增加p53 Tm值的。

（C）p53靶向折叠策略（TPF）对不同结构型p53突变体具有不同的功能恢复效率及机制。在人体内，结构型p53突变体的Tm小于环境温度环境温度（37℃），因此处于非折叠状态（图i）。当使用图示的三种TPF策略实现“Tm大于环境温度Tambient”时，结构型突变体会重新折叠，要么重新折叠成和野生型完全一样的结构（子图ii），要么还额外具有一个无序的L3环（子图 iii）。在子图ii中，高温敏型突变如β-sandwich突变、V272M、R282W因为远离与DNA结合有关的L3环，使得这些突变体在重新折叠时能重新组装出野生型的L3 ，从而可以被TPF高效恢复功能；在子图iii中，非/低温敏型突变如G245S和R249S位于L3环并破坏了L3环，导致这些突变体在整体重新折叠后组装出无序的L3环，从而不能被高效恢复功能。（图片来源：Cancer Discovery&卢敏团队）

第四个误解是认为结构型p53突变体会错误折叠（misfolded）。结构型p53突变体的Tm值低于人体体温37°C，因此，它们在人体内处于非折叠状态（unfolded），没有三级结构（图C，子图i）。在特定条件下，当Tm值重新大于环境温度时（例如通过小分子结合p53的口袋以提高p53的Tm值、通过基因工程方法在第二位点导入促进结构稳定的突变来提高p53的Tm值、降低环境温度），这些突变体会重新折叠，折叠后会出现两种情况：第一种是重新折叠成和野生型p53完全一样的三级结构（图C，子图ii），第二种是重新折叠成在整体上和野生型p53一致但在局部区域包含一个无序的L3环（图C，子图iii）。第二种情况往往是领域内认为p53突变体会错误折叠的原因。“Misfolded conformation”这个术语通常用于描述一种非野生型的、固定的、对应于某种特定新功能的构象，而结构型p53突变体在重新折叠以后，其L3环在第二种情况下既不固定、也不对应特定的新功能。因此，领域内的研究方向应该是“使不折叠的p53蛋白重新折叠”，而非“纠正p53的错误折叠”。

四大障碍

截至目前，绝大多数已报道的p53恢复剂都是广谱性恢复剂，少数为特异性靶向Y220C 单突变体的p53恢复剂，该综述归纳了研发广谱性p53恢复剂的四大障碍（图 1A，粉色框）。

第一个障碍是缺乏可理解的作用机制（MoA），这是确定化合物是否为靶向化合物的基石。如前所述，通过修饰单个暴露的半胱氨酸来恢复p53 DNA结合型突变体或结构型突变体的功能还缺乏明显的作用机制。不过，值得关注的是，在众多广谱性p53恢复剂中，ATO及其类似物在恢复p53结构型突变体方面具有可解释的MoA——这类化合物通过将蛋白内部的Cys124、Cys135和Cys141氨基酸胶联在一起，从而促进结构型p53突变体折叠。

第二个障碍是缺乏对构效关系（structure-activity relationship，SAR）的理解。理解SAR对于药理学家验证其所提出的结构学模型、挑选出最具潜力的候选化合物以开展昂贵的临床试验至关重要。目前，绝大多数广谱性p53恢复剂都缺乏这些至关重要的SAR研究，进而阻碍了对所提出的结构模型与SAR之间相容性的进一步研究。ATO及其类似物是例外。在它们的结构模型中，它们释放出砷（As）或锑（Sb）原子来结合突变的p53。在SAR研究中，不能在细胞中释放As/Sb原子的As/Sb化合物对恢复p53突变体无效，这与它们的结构模型一致。

第三个障碍是缺乏对细胞中靶点特异性的研究——这是靶向化合物在人体内与其靶蛋白结合以调控其功能的先决条件。一般来说，靶点特异性主要取决于小分子与其结合口袋的互补性（图B）。然而，当前大多数广谱性p53恢复剂与暴露在p53上的半胱氨酸的某个巯基结合，而不与任何口袋结合。这类化合物应该缺乏靶点选择性。事实上，确实，在p53的10个半胱氨酸中，这些恢复剂与所有5个暴露的半胱氨酸（C124/C182/C229/C275/C277）混杂结合。此外，据报道，这些化合物还可以与多种多样含有暴露巯基的蛋白以及含有巯基的谷胱甘肽（GSH）相互作用。相比之下，ATO及其类似物在细胞模型中显示出靶向p53的特异性。这种特异性源于砷更倾向于结合三巯基（trithiol，而且这三个巯基之间的相互距离必须刚好合适，以便能和砷原子形成3根共价键）而不是单巯基或二巯基，以及结合未被锌占据的半胱氨酸三联体口袋。细胞中适合砷结合的半胱氨酸三联口袋的数量可能是有限的。据称，迄今为止，p53是唯一具有这种口袋的共晶结构证据的蛋白质。

第四个障碍是缺乏用于在临床试验中筛选匹配患者的明确的可适用突变体的清单。如前文所述，目前还没有能够恢复所有p53突变体功能的是广谱性p53恢复剂。例如，通过靶向蛋白折叠策略（TPF）所研发的p53恢复剂，仅能恢复结构型p53突变体的功能。更复杂的是，即使在这些结构型突变体中，TPF策略对不同突变体的恢复效率也存在差异（图 1C）。

温度敏感（temperature sensitive，TS）亚型结构型突变体通常是最容易被TPF策略恢复功能的突变体。温敏型突变体的定义是：能够在环境温度（Tambient）降低时恢复功能的突变体。由于降低Tambient使“Tm > Tambient”成立，这将促进结构型p53突变体的重新折叠，因此可以推断TS型p53突变体是一类重新折叠以后能够组装出完整DNA结合面（从而恢复DNA结合能力和肿瘤抑制功能）的p53突变体（图 1C，子图 ii）。典型的温敏型突变（如β-sandwich突变、V272M、R282W）通常发生在离DNA结合表面相对较远的地方，这使得在p53重新折叠过程中能够组装出完整的DNA结合面。因此，任何能够促进“Tm > Tambient”这个不等式成立的策略，包括ATO及其类似物的药理学策略、遗传学策略、降低环境温度的策略，都具有恢复TS亚型结构型p53突变体功能的潜能。

反过来，非温敏型的结构型突变体是那些即使（被低温诱导）重新折叠也无法组装出完整DNA结合面的突变体（图 1C，子图 iii），支持证据包括：典型的非温敏亚型或低温敏亚型的结构型突变体（如R249S、G245S）通常发生于结合DNA的L2-L3 motif，这些突变体在重新折叠以后不能组装出完整的DNA结合面，解释了为什么它们在满足“Tm > Tambient”蛋白整体重新折叠以后仍难以被TPF策略恢复功能。

有效性评估标准

P53药物研发领域亟需可靠且简便的标准来评估现有及未来的p53恢复剂的有效性。在靶向治疗领域，用于评估新发现的靶向小分子的核心标准包括：具有可以解释MoA的结构模型、SAR与结构模型具有相容性，但并不是所有细胞生物学实验室都能轻易开展相关评估。鉴于此，该综述提出了4项普通细胞生物学实验室都可以轻易测试的有效性评估标准（图A，第二个灰色框）。

第一项标准是采用确认有效的、敏感的p53活性分析实验系统，评定标准如，p53野生型样品的信号强度比p53缺失和p53突变型样品高一百或几百倍，例如荧光素酶报告基因检测实验（luciferase reporter assay）、使用PAb1620抗体的特异性免疫沉淀实验（PAb1620只识别折叠状态下的p53）。值得注意的是，广泛使用的PAb1620免疫荧光染色法可能不能灵敏地区分野生型p53、p53缺失和结构突变p53，这可能是由于在细胞固定过程中p53不可避免地发生变性，导致不能被PAb1620抗体识别。此外，温敏亚型的结构型突变体如 R282W和V272M即使已经完全重新折叠，也不能被PAb1620抗体高效识别，这可能是由于p53的DNA结合域的拓扑结构限制。

第二项标准是需加入野生型p53作为对照，这经常被忽视。加入这个对照样品有助于评估恢复剂离完全恢复p53功能还有多远。例如，尽管ATO上百倍地促进p53-R175H这一低温敏亚型结构型突变体的蛋白折叠，实现了蛋白折叠的完全恢复；但它仅仅3-4倍地提高p53-R175H的转录活性，远远不足以实现转录活性的完全恢复。

第三项标准是引入一组功能恢复潜力明确的p53突变体作为内部对照。结构学机制以及大规模实验都表明，靶向蛋白折叠（TPF）策略对不同p53突变体的恢复效力由突变体固有的突变特性预先决定。 研究表明，三种p53靶向折叠方法（低温组织培养、ATO处理、PAT处理）恢复800种常见p53错义突变体的转录活性效力排序是一致的：高温敏亚型结构型突变体（如V272M/R282W）> 非/低温敏亚型结构型突变体（如R175H/G245S/R249S）> 非结构型突变体（如R273H/R248Q）（图C）。 因此，如果一种新发现的p53恢复剂对这些不同类型突变体展现出相同程度的恢复效果，那它可能不是直接靶向p53突变体。

第四项标准是评估恢复剂对p53靶基因上调能力的时候，必须评估足够多的p53靶基因（理想情况是评估所有p53靶基因），而非只评估或只展示少数几个靶基因。有效的p53恢复剂应该诱导p53靶基因整体上调，且特异性上调。

经验总结

• 临床转化四项规范

尽管过去已有多款p53恢复剂进入临床，但尚未发现任何统计学显著的患者获益。该综述总结了有望推动实验室发现的p53恢复剂进入临床试验的4项规范：1）需要具有可解释的结构模型（MoA）以明确分子的靶向模式；2）SAR与提出的结构学模型需相互兼容以确保结构学模型的正确性；3）需要具备靶点特异性；4）需有明确的可适用突变体的清单以便进行精准患者入组。

• 适应症选择

由于 p53 在几乎所有癌症类型中都会发生突变，因此， p53 恢复剂的临床试验还需考虑癌症类型。在血液系统恶性肿瘤中， TP53 突变是一个明确的驱动突变，一些证据包括 TP53 突变与患者预后不良相关，复发患者 TP53 突变频率增加，共同发生的驱动突变有限等。因此，血液系统恶性肿瘤可能是 p53 恢复剂开展临床试验理想的癌种选择。首次在人体内（ First-in-human ）实现 p53 突变体功能恢复就是利用 ATO 在血液系统肿瘤患者中取得的。

• 经验总结

回首靶向p53突变体的数十年的研究，科学家们也总结了一些经验教训，包括在药物发现阶段，需选择有功能恢复潜力的p53突变体（如结构型突变体），并采用具有科学逻辑的功能恢复策略（如TPF策略）。此外，在临床试验阶段，需选择合适的p53恢复剂（如满足上述4项有效性评估标准及临床转化规范的恢复剂），并招募最可能产生临床获益的匹配患者（如携带温敏亚型的结构型p53突变体的患者）。

未来展望

该综述提出，当前该领域的一个重要任务应该是利用前文提到的4项评估标准来评估现有和未来的p53恢复剂的有效性，并选择符合上述4项临床转化规范的恢复剂进行临床试验。尽管ATO符合所有这些评估标准和临床规范，但作为一种已获批的老药，缺乏显著的商业价值，因此，需要科学家、临床医生、制药公司之间更紧密的合作，以验证其用于治疗TP53突变癌症患者的疗效。

该领域的另一个“任务”是在p53上鉴定新的配体结合口袋（见图A，黄色框）。在癌症靶向治疗领域，一个蛋白的可成药性（druggability）在很大程度上取决于其深层疏水口袋的存在（供小分子紧密结合）。这一原则同样适用于p53。p53-Y220C上的Cys220口袋的发现，在过去几十年中极大地促进了众多Y220C单突变体特异性恢复剂的研究；然而，Cys220口袋是Y220C突变体特有的，而癌症相关的p53突变体有超过1000种。卢敏团队2021年发现的砷结合口袋（As-binding pocket, ABP）在几乎所有p53突变体中都存在，但由于该口袋空间较小，开发靶向ABP口袋的新型p53恢复剂具有较高挑战。因此，该领域中的一个主要挑战是在p53中鉴定更多的配体结合口袋，无论是变构口袋，还是被掩埋因而难以被发现的口袋。

自1979年被发现以来，围绕p53的研究已经走过了45年。期待在对历史研究的充分总结和思考下，p53药物研发能够早日取得实质性突破，迎来诸如KRAS赛道的曙光。

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[5]Xiao, S., et al., Characterization of the generic mutant p53-rescue compounds in a broad range of assays. Cancer Cell, 2024. 42(3): p. 325-327.

[6]Song, H., et al., Diverse rescue potencies of p53 mutations to ATO are predetermined by intrinsic mutational properties. Sci Transl Med, 2023. 15(690): p. eabn9155.

[7]Song, H., et al., Drugging tumor suppressor p53: barriers, criteria, and prospects. Cancer Discovery, 2024. 14(11).

[8]https://www.nature.com/articles/d41573-020-00130-z

[9]https://www.cell.com/cancer-cell/abstract/S1535-6108(24)00133-8

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