解析氮杂吲哚类MAP4K1抑制剂BAY-405的发现与结构优化

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丝裂原活化蛋白激酶1（MAP4K1）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在T细胞受体刺激下游起着免疫检查点的作用。前列腺素E2（PGE2）和转化生长因子β（TGFβ）是肿瘤微环境中常见的免疫调节剂，可增强MAP4K1活性。因此，抑制MAP4K1是诱导癌症患者治疗性T细胞应答的一个极具吸引力的免疫肿瘤学概念。德国癌症研究中心团队对氮杂吲哚类化合物1进行了系统性优化，发现了强效选择性MAP4K1抑制剂38（BAY-405）。BAY-405在生化和细胞检测中展现出纳摩尔级的效力，并且在口服给药后能在体内达到有效药物浓度。研究表明，BAY-405可增强T细胞免疫，并克服PGE2和TGFβ的抑制作用。在荷瘤小鼠中，BAY-405表现出了T细胞依赖性抗肿瘤疗效。此外，在抑制MAP4K1的同时阻断程序性死亡受体配体1（PD-L1）可产生更出色的抗肿瘤效果，说明了二者具有互补性。

药渡CyberSAR系统提供了对MAP4K1抑制剂分子的深入解析。系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的活性分子，并以研发阶段时光轴的形式呈现了潜力Hit。此外，CyberSAR还提供了适应症和试验设计的可视化分析，帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在本案例分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。

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研究背景

随着靶向细胞表面蛋白CTLA-4、PD-1以及PD-L1的免疫检查点抑制剂（ICI）抗体的出现，癌症药物研发的范畴得到了极大拓宽。鉴于多数癌症对ICI治疗存在耐药性，且肿瘤微环境（TME）会通过多种机制干扰免疫，所以探寻能进一步提升免疫肿瘤治疗方案疗效的互补性免疫刺激策略变得尤为重要。

在众多潜在靶点中，丝裂原活化蛋白激酶1（MAP4K1）备受关注，它是一种仅在造血细胞系中表达的丝氨酸/苏氨酸激酶，又称造血祖细胞激酶1（HPK1）。MAP4K1凭借其富含脯氨酸的结构域与造血细胞内诸多参与T细胞受体（TCR）、B细胞受体以及细胞因子诱导信号传导的衔接蛋白相结合。当TCR受到刺激时，MAP4K1的Tyr381位点发生磷酸化，进而被招募至TCR信号传导复合物中，借助自身丝氨酸/苏氨酸激酶功能，尤其是使SLP76衔接蛋白在Ser376位点磷酸化的方式，诱导该复合物解离，从而对TCR下游信号传导起到负反馈作用。同时，肿瘤微环境中常见的免疫调节剂如前列腺素E2（PGE2）和转化生长因子β（TGFβ）能够触发MAP4K1抑制T细胞功能，这意味着对MAP4K1进行抑制有望以与ICI抗体互补的方式增强抗肿瘤T细胞免疫。相关小鼠实验显示，缺乏MAP4K1或表达其无激酶活性变异体的小鼠，T细胞功能增强、抗肿瘤免疫力提高，且表型正常、具备生育能力，也无淋巴细胞发育缺陷，这为癌症治疗提供了思路。

为找到强效选择性MAP4K1抑制剂，此前已开展了众多研究，虽然部分化合物在临床前模型中有一定成果，但结合激酶选择性、效力及药代动力学特性仍是难题。本研究首先通过高通量筛选技术发现了氮杂吲哚类先导化合物1，化合物1虽有MAP4K1抑制活性，但激酶选择性与药物代谢动力学特性不佳。经过构效关系研究及优化，最终获得了化合物38（BAY-405），它是一种高效、高选择性的MAP4K1抑制剂，有着良好类药特性，在体内能有效暴露并诱导强效抗肿瘤T细胞免疫，为癌症治疗带来新希望。

结果与讨论

先导化合物1的发现

研究人员首先开发并验证了基于重组人GST-MAP4K1融合蛋白的生化激酶检测法，确定了60160个抑制酶活性至少在30%的初始Hit化合物。经结构精简与重测确定了进行IC50测试的4497个化合物，并得到了3765个低IC50化合物。考虑到小鼠模型药理学测试重要性，研究人员还测定小鼠同源MAP4K1的IC50，发现多数化合物在人鼠靶点活性相关性好。通过多方面评估，最终筛选出了先导化合物1（BAY-755），此化合物在针对人MAP4K1的相关检测中展现出高活性（IC50=82nM）。

构效关系研究

化合物1能抑制Rho相关蛋白激酶家族中的ROCK1和ROCK2，但因抑制它们可能产生心血管副作用，所以要提高对该家族的选择性。化合物1对ROCK2具有个位数纳摩尔效力（IC50=2nM），与对MAP4K1的效力存在40倍差异。鉴于化合物1缺乏与ROCK2结合的X射线结构数据，而这两种激酶都有一个甲硫氨酸“把关残基”，所以指向ATP口袋后壁的氮杂吲哚的C3位置可能并非调节对ROCK选择性的首选之处。因此，研究人员起初聚焦于嘧啶和二氟苯基（A环）部分来改善ROCK2选择性。

研究发现，用脲（2）取代嘧啶可使MAP4K1抑制活性提高10倍（IC50=7nM），脲基部分通过双齿氢键与MAP4K1中的Asp101侧链相互作用，但ROCK2选择性问题仍然存在。在探究A环影响时发现，去除单个氟原子（3）使效力大致下降2倍，去除第二个氟原子（4）会导致效力进一步下降2倍。此外，氟原子的排列方式也起着重要作用，2,5-二氟异构体（5）相较于2效力下降了4倍。并且，对A环的这些修饰均会导致代谢稳定性下降。另外，A环结构改变，如引入氮杂吲唑、环胺等均导致效力下降，且这些改变对化合物的ROCK2及其他激酶选择性并无改善甚至变差。上述结果表明2,6-二氟取代A环的存在十分重要。

药代动力学研究发现，化合物2体内清除率中等、生物利用度较差。为改善药代动力学特性及ROCK2选择性，研究人员对脲侧链进行了改造。引入酰胺以降低吗啉的碱性，化合物6对MAP4K1的活性与化合物2相当，体内清除率降低了4倍多，生物利用度提高到28%；带有芳香基团侧链的化合物7对MAP4K1的IC50为9nM，但其体内清除率比化合物6高出了近3倍，生物利用度也显著降低（F=2%）；保留了两个氢键供体排列的五元杂环类化合物8对MAP4K1的IC50为161nM；带有醚类侧链的化合物9的整体性质较为平衡，与化合物6相似，具有进一步探索的潜力；噁嗪类化合物11显示出极佳的效力（IC50=3nM），但体内清除率较高，生物利用度中等（F=26%），是首个对MAP4K1的活性大于对ROCK2活性的化合物；氟取代的噁嗪类化合物12表现出与11相当的活性和选择性特征，同时体内清除率有所降低，生物利用度有所提高（F=69%），但存在稳定性差、心血管毒性、激酶选择性低等问题。

对噁嗪部分的构效关系研究发现，化合物13对ROCK2的活性和选择性较低，但更易合成，且在碱性介质中的稳定性有所提高；对噁嗪上的羟基进行甲基化后，化合物14的活性与13相当，说明羟基为非关键基团，可进行替换以提酸稳定性；未被取代的噁嗪类化合物15和偕二甲基类似物16的活性结果显示，噁嗪的取代情况对效力影响不大，可通过调节噁嗪取代基来提高水解稳定性；噁唑啉化合物17较15效力下降了10倍以上，这凸显出对六元环结构的偏好；噻嗪（18）、胍（IC50=34nM）以及脒（IC50=44nM）取代均导致效力下降，表明噁嗪是保持MAP4K1效力的优选结构单元；氟化噁嗪化合物19代谢稳定性极佳，但与甲基化类似物13和11相比，活性有所降低；与化合物15相比，在噁嗪上引入偕二氟基团（20）导致效力下降。上述化合物对ROCK2的选择性都相对保持稳定，增大噁嗪上的取代基团体积可能会提高选择性。综合来看，噁嗪取代化合物可通过降低噁嗪环的电子云密度来调节代谢稳定性，引入吸电子基团导致活性和选择性降低，杂环的p

K

a与生化效力相关。细胞活性与结合竞争测定数据相关，不过二者IC50有差异，这与ATP及蛋白结合影响有关。

对氮杂吲哚C3位置的研究显示，在C3位含小取代基（如CF3、CN、Cl等）的化合物，除R2=H的未取代氮杂吲哚外，均能维持个位数纳摩尔级效力，且像CF3这样较大取代基对ROCK2选择性优于空间位阻小的取代基。含大体积芳基取代基（23和24）的化合物对ROCK2选择性大幅提高，但二者在大鼠药代动力学实验中生物利用度极低（F%<10%）。含异丙基的化合物25在生化（

IC

50=1nM）和细胞（

IC50

=460nM）实验中效力优异，且对ROCK2选择性超10倍，化合物27证实了该有利趋势。环丙基化合物26选择性较低，含氰基的环丙基化合物28能提高代谢稳定性。氟化环丙基化合物中，二氟甲基类似物29性质与27相似，含三氟甲基的化合物30选择性（ratio ROCK2/MAP4K1=55）和代谢稳定性（Fmax=56%）均提高。将环扩大为环丁基（31）或环戊基虽可进一步提高对ROCK2的选择性，但会对代谢稳定性产生负面影响。

以化合物30为基础，研究人员将注意力转回到对噁嗪的修饰上。噁嗪4位取代（32、34、35）可使化合物对ROCK2的选择性进一步提高，而5位取代（33）会降低化合物的效力。化合物34和35虽体外/体内相关性良好，但在大鼠肝细胞中稳定性一般，且体内清除率较高、生物利用度较差。四氢呋喃并合到噁嗪形成化合物36，与30相比，36对ROCK2的选择性下降。螺-四氢呋喃化合物37较34能维持良好的效力和选择性，但体内药代动力学性质与之相似。相较于化合物37，螺-四氢吡喃化合物38的效力和选择性进一步提高，且体外代谢稳定性提高，大鼠体内清除率降低，生物利用度达到38%。

血浆及水解稳定性评估发现，化合物12因CF3和噁嗪部分不稳定导致水解稳定性差，替换成CF3（13）可改善化合物血浆及pH=10时的水解稳定性；氮杂吲哚C3取代基是影响血浆稳定性的关键因素，含脂肪族取代基的化合物（25）血浆稳定性较含吸电子基团的化合物（12、13）更优；去除羟甲基后，化合物16在中性及酸性条件下化学稳定性提升，仅在pH10时有轻微不稳定；化合物38在中性及酸性条件下稳定，在pH=10时仅轻微不稳定且在大鼠和人类血浆中无降解，整体稳定性良好。

BAY-405体外及体内性质分析

化合物38（BAY-405）在效力、选择性、DMPK参数、血浆及化学稳定性方面表现突出，成为最具潜力候选化合物并进入进一步体外和体内特性分析。在活性与选择性方面，BAY-405对MAP4K1有强效活性，生化实验中对ROCK2选择性比值为130，针对373种激酶组成的外部激酶组其选择性得分较化合物1（BAY-755）有显著提升，对参与细胞周期调控和TCR信号传导相关激酶均有良好选择性。然而，38（BAY-405）对在T细胞免疫反应中有作用且与MAP4K1密切相关的MAP4K3选择性比值仅6.5，可能存在一定影响。

在激酶结合特性方面，38（BAY-405）在细胞裂解物蛋白质组学的激酶选择性测定中能以亚微摩尔级

K

d进行结合，是ATP竞争性活性位点抑制剂，这一点由激酶抑制（

IC50

=11nM）和ATP结合竞争测定（

IC50

=6.2nM）数据所证实，在高ATP激酶活性测定中

IC50

值的显著变化进一步支持了该结论。同时，38（BAY-405）对猴子、大鼠和小鼠的MAP4K1直系同源物有相似效力，结合常数与生化检测数据相符。在细胞活性方面，38（BAY-405）能够以亚微摩尔级活性（

IC50

=0.63μM）抑制SLP76的磷酸化。其理化性质显示，38（BAY-405）在pH=6.4的PBS中的溶解度较低，仅为0.3mg/L，在pH=7.5时的logD为2.8，亲脂性较高。在代谢稳定性方面，38（BAY-405）总体呈现出中度到良好的稳定性，在啮齿动物（如小鼠和大鼠）中的代谢转化率低于高等物种（如狗、猴子和人类）。在渗透性及酶相关特性方面，38（BAY-405）的Caco-2渗透性较低，表观渗透系数

P

app

（A→B）=7.4nm/s，ER=5。细胞色素P450（CYP）抑制情况良好，对2C8和2C9仅表现出微弱抑制，但存在PXR反式激活，对应CYP3A4诱导的NOEL为0.75μM。在hERG通道结合方面，呈现微摩尔级结合，相对未结合的细胞磷酸化SLP的

IC50

，其潜在hERG选择性范围预计大于10，风险较小。在安全性方面，该化合物在AMES试验中结果为阴性，激酶选择性提高。在药代动力学方面，38（BAY-405）在啮齿动物体内清除率适中、分布容积高、半衰期长；在狗体内清除率高、半衰期短，与体外结果相符。在大鼠体内的生物利用度为16-38%，而在狗体内仅为9%，这可能是由于狗和大鼠胃部pH值不同，导致碱性噁嗪的质子化程度较低，进而使整体溶解度降低。

BAY-405与人MAP4K1激酶结构域复合物的X射线结构呈现出ATP竞争性结合模式，吡咯并吡啶依靠氢键锚定在铰链区，三氟甲基-环丙基处于激酶后袋，呈DFG-in构象，氟取代的A环垂直于铰链结合杂环且构象稳定，核苷酸结合环末端能与Tyr28侧链形成π-π堆积作用，噁嗪与Asp101羧酸成双齿氢键，四氢吡喃环与激酶结构域则无直接相互作用。

BAY-405体外药理学性质

BAY-405能够以靶点特异性方式抑制MAP4K1对SLP76的磷酸化，这在抗CD3抗体刺激的JurkatT细胞、原代人PBMC培养物以及抗CD3/CD28刺激的小鼠脾细胞培养物等实验中均得到验证。在原代人PBMC培养物的细胞因子分泌检测实验中，BAY-405能够克服PGE2和TGFβ对T细胞活性的抑制，且在多供体PBMC培养物中，其对T细胞刺激作用的EC50处于100-200nM之间，在多种抗CD3抗体浓度下，仅当有PGE2或TGFβ存在时可增强人T细胞活化，同时其对小鼠脾细胞培养物中的T细胞反应性也有增强作用。然而，在MAP4K1激酶失活敲入的T细胞中，未观察到BAY-405对T细胞的刺激作用，这验证了BAY-405依赖MAP4K1发挥作用的特异性机制。此外，人及小鼠T细胞的SLP76磷酸化IC50和T细胞活化EC50表现出了约10倍的差异，推测前者IC50高与检测时间短有关，T细胞活化检测的EC50值可能与体内药物暴露水平关联性较大。

BAY-405增强体外及体内抗肿瘤T细胞反应性

在体外实验中，BAY-405能剂量依赖性增强转导特定T细胞受体的人类T细胞对黑色素瘤细胞的杀伤能力，且无直接细胞抑制作用。体内实验结果显示，小鼠口服BAY-405后暴露量呈剂量依赖性增加。在B16黑色素瘤肺定植实验中，BAY-405可增强肿瘤特异性T细胞体内效应功能，使病变数量呈剂量依赖性减少，不过在MAP4K1激酶失活敲入的小鼠中无此抗肿瘤作用。在皮下B16黑色素瘤及EMT6肿瘤模型中，BAY-405也有抗肿瘤功效，作用依赖T细胞免疫反应且无明显毒性。BAY-405处理后，小鼠脾脏pSLP76水平降低。在B16黑色素瘤肺定植及皮下肿瘤模型中，PD-L1阻断抗体和BAY-405单独用药均有活性，二者联合使用时呈现出更显著的肿瘤抑制效果。

结论

本研究以化合物

1

为先导化合物进行结构优化，得到了BAY-405。BAY-405对人MAP4K1的抑制效力大幅提升，其激酶选择性评分从化合物

1

的S=0.13优化至S=0.080，且MAP4K1是其抑制效力最强的激酶。此外，BAY-405还具备卓越的类药特性，能在多种临床前物种中口服使用，体内安全性良好，在同基因小鼠肿瘤模型中，BAY-405可在无体重减轻或其他明显药物毒性迹象的情况下，实现T细胞依赖的肿瘤生长抑制。临床前数据表明，将对MAP4K1的药理抑制与通过抗体介导阻断PD-1/PD-L1轴相结合，可增强抗肿瘤功效。这些药物的互补性与它们调节T细胞活化过程中不同信号这一事实相符；MAP4K1抑制剂调节T细胞受体（TCR）下游信号，而阻断PD-1信号则调节T细胞共刺激。此外，BAY-405可克服存在于多种实体瘤肿瘤微环境中的TGFβ和PGE2对T细胞反应性的抑制，其口服给药途径和较短半衰期有利于精细调节T细胞反应并减轻免疫相关不良事件。总之，这些研究结果表明，BAY-405有望作为选择性MAP4K1抑制剂开展进一步的临床研究，并且无论是单独使用还是与ICI抗体联合应用都极具潜力。

文献来源

10.1021/acs.jmedchem.4c01325