浙大叶丽丹团队工程化大肠杆菌，从葡萄糖中生物合成尼龙12单体

在工业领域中，尼龙 12 具备出色的性能，如低吸水性、低相对密度、高耐磨性、阻燃性等，广泛应用于 3D 打印、汽车制造、油气开采、医疗器械、电子信息、汽车零部件等领域。然而，传统的尼龙 12 化学合成步骤多，需要使用有毒和腐蚀性的原料，导致技术门槛高、环境污染严重。

与传统方法相比，微生物合成则具有显著的优势。目前，尼龙 12 单体的生物生产主要通过多酶级联反应将十二烷二酸 (DDA) 或其酯转化为 ω-氨基十二烷酸 (ω-AmDDA) 或其酯。这些研究的底物 DDA 及其衍生物通常来自椰子油和棕榈仁油，引发了与森林砍伐和生物多样性丧失有关的重大环境问题；此外，使用食用植物油进行工业油脂化学品生产加剧了土地应分配给燃料还是食物的争论。

近日，浙江大学叶丽丹团队在该领域取得了重大进展，在一篇题为“De novo biosynthesis of nylon 12 monomer ω-aminododecanoic acid”的研究中，研究人员利用大肠杆菌从葡萄糖出发，成功实现尼龙 12 单体 ω-AmDDA 的高效合成，为尼龙 12 的可持续生产带来新的思路，相关成果在线发表于 Nature Communications。

图｜从葡萄糖到尼龙 12 单体合成路径

首先，研究人员通过基因工程手段在大肠杆菌中构建了合成 ω-AmDDA 的完整代谢途径。

此前已有人证明，通过引入来自加州月桂（Umbellularia californica）的硫酯酶 BTE，可以在大肠杆菌中生产高比例的游离 DDA。如果这种酶可以与将 DDA 转化为 ω-AmDDA 的多酶级联途径一起在大肠杆菌中异源表达，DDA 作为中间体的选择性积累可能使从葡萄糖开始生物合成 ω-AmDDA 成为可能。

在这项研究中，研究人员引入来自加州月桂的硫酯酶 BTE，从而使大肠杆菌能够选择性地合成 DDA。随后，利用多酶级联反应，将 DDA 转化为 ω-AmDDA。这一过程涉及多个酶的协同作用，包括 P450 酶催化的羟基化反应、醇脱氢酶的氧化反应以及转氨酶的转氨反应等。

最终，配合一系列优化培养条件，如调整 pH 值、诱导剂浓度等，工程菌株合成 ω-AmDDA 产量可以达到 27.5 mg/L。

脂肪酸（包括 DDA）可能会在生物合成后分泌，导致 DDA 转换酶无法接触底物。通过过表达自假单胞菌 GPo1 的外膜蛋白 AlkL，能够解决底物转移问题，当使用重组大肠杆菌菌株以 DDA 为底物进行生物转化时，AlkL 过表达使 ω-AmDDA 的产量提高了 20.3%。

为了进一步优化产量，研究人员采取了多种策略，包括：

模块化途径工程。充足的前体供应对于高效生产至关重要，因此，加强菌株合成 DDA 可以进一步改善 ω-AmDDA 的生物合成。根据中心代谢途径，DDA 的合成途径分为三个模块：上游糖酵解模块、乙酰辅酶 A 活化模块、酰基-ACP 合成模块，通过优化改进这三个模块，实现充足但不过量的 DDA 供应，ω-AmDDA 滴度最高达到 242.8 mg/L。

辅因子工程。通过调节 NADPH 和 NADH 等关键辅因子的供应、加强 ATP 供应等，最终获得的菌株在摇瓶发酵 18 小时后产生 324.4 mg/L 的 ω-AmDDA。

增强氧化应激耐受性工程。DDA 及其衍生物的产生和积累会破坏膜结构，削弱位于膜上的电子传递链的功能，导致活性氧（ROS）的积累，过量的 ROS 会损害细胞膜、蛋白质和核酸等必需的细胞成分，导致 ROS 应激。通过增强氧化应激耐受性，构建的菌株经过摇瓶发酵 18 h，ω-AmDDA 产量为 370.9 mg/L，生物量增加了 64%。

蛋白质工程。在 ω-AmDDA 的全细胞催化和从头合成中，P450 酶将 DDA 羟基化形成 ω-OHDDA 至关重要。通过对可能参与催化的结构域的位点进行饱和诱变，最终获得了活性提高 89% 的组合突变体 CYP153Am4-NCP；此外，通过 N 端融合分子间亲和增强结构增强 CYP153Am4-NCP 的蛋白质二聚化，进一步提高了羟基化活性。得到最终菌株培养 18h 后其 ω-AmDDA 产量为 471.5mg/L，较对照菌株高出 54%，同时 DDA 积累量从 43.9mg/L 降至 25.3mg/L。

图｜ω-AmDDA 细胞工厂的构建与优化

总之，本研究开发了一种多层次调控策略，以实现从葡萄糖高效从头生物合成尼龙 12 单体 ω-AmDDA。研究人员整合了模块化途径工程、辅因子工程、耐受性工程和蛋白质工程来优化复杂的合成途径。通过将内源脂肪酸代谢与将 DDA 转化为 ω-AmDDA 的异源多酶级联连接起来，构建了一种能够从葡萄糖生物合成 ω-AmDDA 的工程大肠杆菌菌株。

此外，研究人员通过加强和平衡四个途径模块：糖酵解、乙酰辅酶 A 活化、酰基-ACP 合成和异源 DDA 转化、调节 NAD(P)H 和 ATP 供应、增强氧化应激耐受性以及设计限速 P450 来重建该细胞工厂的代谢平衡。这种综合方法可以构建高效的 ω-AmDDA 细胞工厂，为可持续的葡萄糖衍生尼龙 12 生产铺平道路。

参考文献：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-55739-0

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