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液-液相分离组装的凝聚囊泡提升生物药物递送效率

细胞内的生化活动通常在由磷脂层或囊泡膜包裹的隔室中进行，这些隔室促进物质运输、新陈代谢和储存。然而，传统脂质膜存在渗透性差和物理屏障等局限性，阻碍其在疾病治疗和货物输送中的应用。相比之下，无膜的液滴状隔室通过液-液相分离（LLPS）形成，并依赖生物分子间的多价相互作用。这类无膜凝聚层在细胞功能和递送平台中展现出潜力，但其易聚结和分解的动态特性限制了长期储存和使用。为此，通过两亲物界面自组装和表面剂的内源性重构，可增强其稳定性。然而，这种方法仍面临扩散限制和界面重新配置的复杂性等挑战。

在这里，浙江大学顾臻教授、李洪军研究员联合中国医科大学附属第一医院刘福囝教授共同报道了胆固醇修饰的 DNA 和组蛋白的液-液相分离形成的凝聚囊泡。与基于磷脂的膜结合囊泡不同，凝聚囊泡表面缺乏膜结构，并由高密度液体层和充满水的空腔组成。通过简单的凝聚过程，作者证明了各种生物制剂，包括病毒颗粒、mRNA、细胞因子和肽，可以无害地直接富集在液相中。与容易发生聚集挑战的液滴状凝聚层相比，凝聚囊泡表现出优异的动力学稳定性，使其成为生物制药的多功能递送载体。作者验证了将溶瘤病毒掺入这些凝聚囊泡中赋予它们强大的溶瘤功效，并在小鼠模型中引发强大的抗肿瘤免疫反应。相关成果以“Coacervate vesicles assembled by liquid–liquid phase separation improve delivery of biopharmaceuticals”为题发表在《Nature Chemistry》上，Ping Wen和Hanwei Huang为共同第一作者。

受囊泡隔室的启发，作者开发了一种基于核酸-蛋白质复合物的 LLPS 凝聚囊泡组装，其中自组装由胆固醇修饰的单链 DNA (Chol-ssDNA) 和组蛋白修饰的单链 DNA 结合实现（图 1）。这些凝聚囊泡通过高密度层封闭和稳定，能够在温和条件下隔离并保护生物药物的活性，同时提高其递送效率。实验表明，这种递送载体通过能量依赖的巨胞饮过程，将溶瘤病毒（ad11）高效内化到肿瘤细胞中，内化效率提升至48倍。在荷瘤小鼠模型中，凝聚囊泡显著增强了溶瘤病毒的驻留时间和抗肿瘤免疫反应，有效抑制肿瘤生长并提升生物疗法的整体功效。

图 1：用于生物药物递送的凝聚囊泡的构建

凝聚囊泡的制备和表征

研究表明，基因组 DNA 和核蛋白的相分离可在真核细胞中形成无膜异染色质结构域。借鉴此机制，作者利用组蛋白和 Chol-ssDNA 在体外诱导相分离。结果显示，组蛋白与 Chol-ssDNA 在不同比例和浓度下可自发形成三种相态：均质溶液 (SOL)、凝聚液滴 (COA) 和以低密度核心及高密度外层为特征的凝聚囊泡 (CV)（图 2a-d）。CV 主要在高组蛋白浓度和较高的组蛋白/Chol-ssDNA 比例条件下形成，具有水介质核心和组蛋白-Chol-ssDNA 混合物构成的高密度外层（图 2c, e）。三维重建图像和扫描电子显微镜（SEM）确认了其独特的子结构，其中核心在脱水后表现为空腔。与传统脂质膜的几何各向异性相比，CV 的分子分布更均匀，直径平均为 1.82 μm（图 2f, g）。此外，光密度分析表明，与 CV 相比，COA 具有更高的凝聚程度（图 2h）。

图 2：基于 Chol-ssDNA-组蛋白的凝聚囊泡的表征

凝聚囊泡的 LLPS 特性

研究发现。CV 在高组蛋白和 Chol-ssDNA 浓度下形成，具备水介质核心和高密度外缘的独特结构（图 2c-d）。CV 的生成依赖于疏水性和多价分子间相互作用，其界面力学显著高于 COA（图 3e），表现出更高的稳定性和较低的分子动态性（图 3a-d）。CV 在电荷调控下展现了卓越的货物招募能力，能有效富集带负电的生物分子（如病毒 ad11、mRNA 和 dsDNA），其负载效率显著高于正电荷货物（图 3h）。此外，低分子量右旋糖酐优先聚集在 CV 内部，而高分子量溶质被排斥，反映了 CV 的隔间选择性。通过 GFP 表达和酶活性实验，CV 封装生物货物后可长时间保持其生物活性（图 3i-j）。在不同温度、pH 和盐浓度范围内，CV 的粒径和浊度均保持稳定（图 3k），表明其在多种条件下具备较强的结构完整性和功能稳定性，展示了其在生物制药递送中的应用潜力。

图3：凝聚囊泡的理化性质。

负载 ad11 的凝聚囊泡的表征

研究表明，通过相分离条件，溶瘤病毒 Ad11 可以高效封装于 COA 和 CV 中，装载效率达约 86.2%（图 4a）。Ad11 在凝聚液相中高度富集，与 Chol-ssDNA 和组蛋白共定位（图 4b），其分布通过 TEM 和冷冻 TEM 成像进一步验证（图 4c-d）。稳定性测试显示，Ad11-CV 在 37°C 孵育 48 小时后几乎无融合现象，表现出优异的稳定性，而 Ad11-COA 由于聚结导致结构不规则（图 4e-g）。此外，CV 保护封装的 Ad11 避免与抗体结合（游离 Ad11 的结合率高达 74.3%），有效避免免疫系统的清除和中和抗体的干扰。CV 的稳定性和保护性表明其在提高溶瘤病毒递送效果中的显著优势。

图4：凝聚囊泡招募溶瘤腺病毒

CV 包装增强 ad11 的细胞内化

研究表明，通过 LLPS 组装的 Ad11-CV 在多种细胞系中表现出显著的自发内化能力，与 Ad11 或 Ad11-COA 相比具有更高的摄取效率（图 5a-e）。TC-1 和 TC-1-hCD46 细胞的实验表明，Ad11-CV 的内化过程不依赖于受体 CD46（图 5b-c）。进一步研究显示，Ad11-CV 的稳定性和带正电的表面特性（图 4e）可能是提高细胞摄取效率的关键因素。在多种细胞系中，Ad11-CV 的摄取效率高出 4.3 至 48 倍。通过抑制剂实验和 TEM 观察，发现 Ad11-CV 的内化是通过能量依赖性巨胞饮作用完成的，而非 Ad11-COA 所采用的其他途径（图 5f-h）。延时成像和显微技术揭示了内化的五个阶段，包括细胞外、细胞表面、细胞膜包裹、内化和变形（图 5i-j）。此外，Ad11-CV 在体外实验中展现出更强的溶瘤性能，对细胞和肿瘤球的毒性均显著高于游离 Ad11 或 Ad11-COA。

图 5：TC-1（独立）和 TC-1-hCD46（依赖）细胞对 ad11-CV 的细胞摄取

ad11-CV对体内肿瘤模型的溶瘤功效

研究表明，Ad11-CV 在异种移植肿瘤模型中表现出卓越的体内抗肿瘤疗效。瘤内注射后，Ad11-CV 显著提高了病毒在肿瘤部位的驻留率，相较于游离 Ad11 或 Ad11-COA，显示出更强的肿瘤停留和分布效果（图 6a-c）。在携带 TC-1 肿瘤的小鼠模型中，Ad11-CV 通过显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存时间展现了最高的抗肿瘤效果（图 6e-h）。研究进一步验证了其免疫调节能力，Ad11-CV 组显示出更高水平的促炎因子 IL-6 和 TNF（图 6i），以及肿瘤中 CD8+ T 细胞和 M1 巨噬细胞的显著增加（图 6j）。此外，Ad11-CV 还能减少肿瘤中 M2 巨噬细胞的比例，并增强巨噬细胞对肿瘤部位的浸润。在较大肿瘤模型中，Ad11-CV 有效抑制肿瘤生长，延长生存期且无明显毒性或副作用。这些结果表明，Ad11-CV 在提高病毒驻留率、调节免疫反应和增强抗肿瘤疗效方面具有显著潜力。

图6：ad11-CV对皮下TC-1肿瘤的体内免疫反应和溶瘤功效

小结

本研究通过 DNA 和核蛋白的 LLPS 形成了具有水腔的异质凝聚囊泡，展现了分层结构及其在招募多种生物制剂中的广泛应用潜力。研究发现，疏水性、电荷以及基于静电效应的多价相互作用是决定相态和驱动凝聚的关键因素。与传统囊泡相比，凝聚囊泡制备简单、环保，并在溶瘤病毒递送中展现了显著的可行性（图示）。未来研究将聚焦于通过物理化学触发实现 LLPS 组装的可控相变，以实现精准药物递送。此外，可将目标分子结合至囊泡表面，以识别特定细胞，拓展在蛋白质运输、基因治疗及信号传递等领域的应用潜力。这种结构的拓扑转变或许还可为治疗生物调节失衡相关疾病提供新的思路。

来源：高分子科学前沿

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