Cell | 全面揭示人类蛋白质组中的锌离子结合位点

撰文 | Sure

锌离子是细胞内广泛使用的金属辅助因子，约10%的人类蛋白质预计与锌结合【1,2】。锌离子通过与蛋白质结合为蛋白质提供稳定性、作为酶促反应的催化剂以及调节蛋白质活性等【3,4】。细胞内锌的总浓度约为200–300 µM，大部分以蛋白结合的形式存在。游离锌离子的浓度则被严格控制在皮摩尔至纳摩尔范围。锌离子的浓度通过锌转运蛋白、储存蛋白和小分子配体 （如代谢物） 进行动态调节。我们熟知的锌指蛋白指的就是一类含有锌指结构域的蛋白，这是一类以锌离子为辅助因子的蛋白质，通常与DNA、RNA或其他蛋白结合。鉴于锌离子与人类蛋白质结合的广泛性及其功能的重要性，全面分析蛋白质组中锌离子的结合位点是一项非常重要的研究课题。但是，由于锌离子结合的非共价特性，现有的研究方法尚未能在蛋白质组范围进行全面的解析。

2024年12月31日，来自美国哈佛医学院的Edward T. Chouchani在Cell上发表了论文The human zinc-binding cysteine proteome。 在本研究中，作者开发了一种基于化学蛋白质组学的新策略，用于在人类蛋白质组范围内量化锌离子与蛋白质半胱氨酸残基的结合状态。

锌离子与蛋白质结合通常通过配位与至少一个半胱氨酸硫醇基相互作用，正如前面介绍的，这种配位是非共价的，因此需要特定条件来保持锌的配位状态。作者针对这个问题，开发了一种基于半胱氨酸反应性磷酸标签 （CPT） 的新方法，用于标记和富集含半胱氨酸的肽段。并将CPT结合串联质谱标签 （TMT） 多重标记化学蛋白质组学结合，以此量化人类蛋白质组中超过5万个的独特半胱氨酸的锌结合状态。通过这种方法，研究捕获了超过11,000种蛋白质的锌结合信息，其中包括诱导性和持续性锌结合的位点。作者使用锌螯合剂TPEN、金属螯合剂EDTA和ZnCl₂分别处理细胞裂解液，以分别映射持续性锌结合位点、持续金属结合位点和可诱导的锌结合位点。根据这些锌离子结合位点，作者发现核蛋白和囊泡蛋白分别在持续锌结合和可诱导锌结合中表现出显著的分布特点。

作者为了验证新方法的结果可靠性，他们将获得锌离子结合位点与ZincBind数据库和预测数据集进行对比，结果表明ZnCPT鉴定了大量已知的锌离子结合蛋白，特别是在持续性锌结合蛋白的鉴定，ZnCPT展现了强大的能力。更重要的是，ZnCPT还可以揭示锌结合的动态变化，特别是可诱导锌结合位点的部分锌占据和动态调控特性。进一步对锌离子结合位点的序列和结构特征进行分析后，作者发现持续性锌结合位点和可诱导性锌结合位点在序列和结构微环境中表现出显著差异。持续性位点更倾向于传统锌指结构，可诱导性位点具有更大的结构灵活性，可能因二硫键和电化学环境变化而动态调节。许多可诱导性锌结合位点在对照条件下仅部分结合锌，表现出动态特性。对ZnCPT的结果进行验证后，发现许多文献中已知的锌结合位点，展示其可靠性和准确性。

文章的最后，作者对锌离子结合蛋白进行了GO功能注释，发现癌症相关通路得到富集。其中就包括了谷胱甘肽还原酶 （GSR） 、GTP环化水解酶 （GCH1） 、核糖黄素转运蛋白 （SLC52A2） 等多种癌症关键依赖性蛋白。作者选择GSR进行功能验证，发现锌离子通过结合GSR的活性位点半胱氨酸 （Cys102和Cys107） 抑制其活性。高浓度的锌离子抑制GSR功能从而使得谷胱甘肽耗尽和氧化型谷胱甘肽水平升高，导致癌细胞氧化应激的激活。在体外实验中，作者也证实了补充锌离子可以显著抑制肿瘤的生长。这一发现表明锌在调控氧化应激和代谢稳态中发挥关键作用，锌调控可能成为针对肿瘤类型的重要治疗策略。

总的来说，作者开发了CPT-TMT技术用于量化人类蛋白质组中的锌离子结合位点，揭示了锌结合蛋白的多样性及其在结构、功能和调控机制上的特点。同时验证了已知的锌结合位点，并发现了多个新靶点，扩展了对锌结合在生物学和疾病中的理解。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.11.025

制版人：十一

参考文献

1. Kr ̨ e_ zel, A., and Maret, W. (2016). The biological inorganic chemistry of zinc ions. Arch.Biochem. Biophys.611, 3–19.

2. Maret, W. (2015). Analyzing free zinc(ii) ion concentrations in cell biology with fluorescent chelating molecules.Metallomics7, 202–211.

3. Passerini, A., Andreini, C., Menchetti, S., Rosato, A., and Frasconi, P. (2007). Predicting zinc binding at the proteome level.BMC Bioinformatics8, 39.

4. Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., and Rosato, A. (2006). Counting the Zinc-Proteins Encoded in the Human Genome.J. Proteome Res. 5, 196–201.

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