Angew | 聂舟团队开发配体响应的人工蛋白质-蛋白质通讯系统构建用于现场可部署的无细胞生物传感

生物信息交流的调控依赖于核酸和蛋白质等生物大分子之间的相互作用与通讯。例如，基因表达的转录与翻译通过转录因子 （TF） 与RNA聚合酶或核糖体等蛋白机器协同实现信号的传递与放大。这些蛋白-蛋白通讯机制构成了生命功能的分子基础，并已在体外被成功模拟和重建。基于该机制的体外转录/翻译 （TXTL） 系统在生物传感、临床诊断、环境监测等领域展现出重要价值。然而，TXTL系统的高复杂性限制了其实际应用，其依赖于多酶级联体系、多种辅因子及合成底物，且响应时间通常长达数小时，难以满足分钟级快速响应的现场检测需求。因此，开发全新设计的人工蛋白-蛋白通讯系统成为关键任务。近年来，随着生物化学和合成生物学的交叉发展，通过理性设计核酸底物及其化学修饰，人工分子通讯工具在重写蛋白质交互逻辑方面展现了巨大潜力。然而，目前的大多数人工蛋白通讯仍局限于“蛋白输入-蛋白输出”的模式，缺乏外源配体诱导的调控功能，这在一定程度上限制了其在生物传感和智能分子机器领域的广泛应用。

近日，湖南大学聂舟/雷春阳教授团队 （文章第一作者为课题组已毕业博士研究生王珂（现为空军军医大学药学系讲师）） 在Angew. Chem. Int. Ed.期刊上发表了文章Ligand-Responsive Artificial Protein–Protein Communication for Field-Deployable Cell-Free Biosensing，提出了一种配体响应的人工蛋白质-蛋白质通讯系统（ligand-responsive artificial protein-protein communication，LIRAC） ，有效解决了当前无细胞生物传感系统中普遍存在的天然转录翻译范式带来的系统复杂性和反应时间长的问题。通过合理设计嵌合DNA适配器 （cDNA） 并精确调控其与两种蛋白质的结合亲和力，实现了转录因子 （TF） 与CRISPR/Cas酶之间的快速高效通讯。LIRAC利用配体调控TF的别构效应，将配体诱导的构象变化直接转化为Cas酶的快速单酶响应。相比传统的TXTL系统，LIRAC大幅简化了反应体系，并将响应时间缩短至仅10分钟。通过构建便携式检测装置与试纸条，该系统成功实现了环境化学物质的快速分析，充分验证了其在环境污染物现场分析中的应用潜力。

Scheme 1.LIRAC系统与基于转录/翻译的传统的NCIVT系统对比。(A)传统的天然蛋白质-蛋白质通讯系统NCIVT的传感原理图，依赖于多酶级联体系、多种辅因子及合成底物，且复杂的转录/翻译过程耗时。(B) LIRAC系统通过重新定义两类没有天然相互作用的转录因子（TF）和CRISPR/Cas酶之间的通迅，能够针对分析物进行快速检测，并通过设计双TFs与Cas酶的通讯，可构建三态逻辑门，实现多污染物的联合检测。此外，LIRAC结合便携式检测设备与试纸条，为现场快速分析提供了高效解决方案。

为了实现TF与CRISPR/Cas酶之间的通讯，通过将TF结合位点与CRISPR/Cas酶识别序列整合来设计cDNA。TF-cDNA相互作用可能掩盖Cas12a RNP的识别区域，从而阻碍其激活。通过整合TetR结合位点 （tetO） 与CRISPR/Cas酶识别序列 （包括PAM、seed region和check point） 来设计 （cDNAI-cDNAIV） ，通过荧光ssDNA报告探针测试TetR结合对Cas12a附属切割活性的影响。在有无TetR的情况下，通过分析cDNA激活Cas12a RNP后1小时的荧光信号终点值，明确了TetR结合不同cDNA对Cas12a的影响，结果显示，cDNAII和cDNAIII在加入TetR后，荧光信号分别降低89.7%和79.2%，而cDNAI和cDNAIV受影响较小。选取抑制效果最佳的cDNAII继续后面的实验，在不同TetR/cDNA比值下测量cDNAII对Cas12a RNP附属切割活性的抑制效果，进一步分析数据，发现当TetR/cDNA比为20.7时，可将Cas12a RNP的活性抑制50%。

为明确TetR对Cas12a RNP识别及结合cDNA的调控作用，采用全内反射荧光显微镜 （Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, TIRFM） 进行单分子荧光成像。通过将Cy3标记的cDNA锚定于玻璃基底，同时以Cy5标记核酸酶缺陷型Cas12a （dCas12a） RNP，实时监测两者的单分子结合事件。实验结果显示，在未处理的cDNA上，dCas12a RNP结合形成的荧光共定位比率达到56.2%，表明其高结合能力。但在TetR预处理的cDNA中，共定位比率显著下降至7.9%，说明TetR结合cDNA，对dCas12a的识别位点形成空间位阻的占位效应。进一步通过添加TetR的配体四环素 （Tetracycline，Tc） 恢复其构象，观察到共定位比率在30分钟内恢复至48.8%。此外，共定位比率随Tc浓度呈剂量依赖性提升，表明Tc诱导的TetR构象变化可有效激活CRISPR/Cas12a切割活性的功能。基于这些单分子实验结果，LIRAC系统通过cDNA构建TetR与CRISPR/Cas12a的人工调控机制，成功构建了具有配体响应特性的蛋白-蛋白通讯系统，该研究结果为LIRAC系统在生物传感中的应用提供了数据基础。

作者通过DNA工程化调控cDNA和Cas12a RNP的结合亲和力。首先，通过设计串联的tetO位点来减少游离cDNA的比例 （δcDNA） ，并结合cDNAI与cDNAII，创建了新的cDNA构建体 （cDNAI&II） ，从而增强了信背比。这一设计有效地降低了背景信号，将LIRAC系统的信噪比从6.3提高至11.8，较原系统显著改善。进一步的优化通过引入诱饵DNA （bDNA） 作为竞争性抑制剂来增加Cas12a RNP的表观米氏常数 （apparent Michaelis constant, Kmapp） ，从而减少背景泄漏。诱饵DNA包含PAM位点，可与Cas12a RNP竞争性结合，使其背景信号减少73.8%。同时，bDNA的浓度依赖性效应表明，在100 nM时，泄漏信号达到最小值。结合优化的cDNAI&II和bDNA，LIRAC系统的信噪比进一步提高至36.9。此外，通过调节TetR浓度，发现LIRAC系统在不同TetR/cDNA比值下能调节灵敏度，表现出比传统体外转录系统更低的检测限，可达0.013 µM。

研究人员比较了LIRAC系统与传统TXTL和IVT系统在生物传感中的性能差异。TXTL、IVT和LIRAC三种生物传感系统的工作机制使用的信号报告分子——增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 、Pepper荧光RNA和FAM-TTATT-BHQ1探针，分别在qPCR仪器上使用相同的FAM荧光通道进行同步分析，从而能够直接比较各系统的响应信号。三种系统的时间依赖性荧光信号变化显示，LIRAC系统在10分钟内显著提高了荧光信号强度，且其响应速度明显优于TXTL和IVT系统。随着Tc浓度的变化，LIRAC系统表现出最佳的动态荧光响应能力。LIRAC系统能够在10分钟内检测到0.1 µM的Tc，而TXTL和IVT系统需要更长的时间才能检测到较高浓度的Tc。对比三种系统在响应时间和灵敏度方面的评估结果，LIRAC系统在10分钟内的信号强度明显高于其他两种系统，即使在Tc浓度均为1 µM时，LIRAC系统的信号强度也超过了TXTL和IVT系统在分别2小时和1小时后的信号强度，显示出LIRAC系统在快速响应和灵敏度方面的显著优势。

研究人员评估了LIRAC系统在多种分析物检测和多蛋白通讯中的应用与性能。首先，LIRAC平台通过优化cDNA序列，使其能够与不同的转录因子(TFs)结合，从而响应特定的目标物。例如，作者通过将HosA结合位点融入cDNA中，开发了一种用于快速检测防腐剂p-HBA的LIRAC生物传感法，能够对p-HBA做出快速且显著的信号响应。此外，针对水中金属离子污染问题，LIRAC系统通过采用铜特异性转录因子CsoR，成功实现了对铜离子 (Cu(II)) 的高灵敏度检测，检测限低至0.22 μM，远低于美国环保署EPA对自来水的标准 (20 μM)，表明LIRAC系统在水质监测中的潜在应用。进一步地，LIRAC系统展现出良好的选择性与高效的正交响应能力，数据显示不同的TF与cDNA的组合具有最低的交叉反应性和极高的特异性。此外，为了增强LIRAC系统的功能，通过设计cDNAI&III变体构建了一个OR逻辑门系统，能够在任一输入TF存在时激活信号输出，证明LIRAC系统可以通过逻辑门设计实现多输入信号调控的潜力。进一步地，通过构建LIRAC系统的三态缓冲器，实现了能够根据不同输入信号调控输出的功能，三态缓冲器的设计包括高输出、低输出和高阻抗状态，展示了LIRAC在复杂信号调控中的潜力。

为了简化现场分析，并消除对复杂实验室设备的依赖，该课题组开发了一种与LIRAC生物传感系统兼容的便携式检测设备。该设备配备了微型荧光探测模块 (mFLD) ，能够以低至5 nM的浓度检测FAM标记的DNA。使用该便携设备，LIRAC系统在5分钟内即可快速检测到0.5 μM铜离子 (Cu(II))，而传统的IVT方法则需要更长的时间才能实现相似的检测。进一步评估了该系统在环境水样中的铜离子检测能力。该系统与ICP-MS并行检测了含有不同浓度Cu（II）的河水样本，结果显示两种方法环境水样的检测信号没有显著差异，证明了该系统在实际环境样品中的鲁棒性。此外，LIRAC系统与ICP-MS方法对比，Pearson相关系数为0.9927，表明两种方法的检测结果高度一致，验证了LIRAC系统在环境水样污染物检测中的实用性。作者将LIRAC系统与侧向流试纸联合使用，用于检测化妆品中的对羟基苯甲酸酯 (Parabens) 。这种系统利用酯酶将对羟基苯甲酸酯水解为p-HBA，随后通过LIRAC系统检测。结果显示，所有测试的对羟基苯甲酸酯在100 μM浓度下均触发了明显的荧光响应，并能通过侧向流试纸读取。该系统能够检测到低至19.4 ppm的对羟基苯甲酸酯浓度，显著低于典型的化妆品 中浓度 (1400-8000 ppm) 。此外，作者测试了10种来自国内外的不同品牌的护肤产品。这些样品通过荧光和侧向流试纸检测，结果表明其中五款产品含有对羟基苯甲酸酯，这与其标签成分一致，展示了LIRAC系统在化妆品安全检测中的可行性，为现场快速分析提供了新工具。

总之，本研究建立了一种新型的配体响应型人工蛋白质-蛋白质通讯系统——LIRAC，旨在克服传统无细胞生物传感系统中存在的复杂性和响应时间长的问题。LIRAC系统通过将非天然相互作用的转录因子 （TF） 与CRISPR/Cas酶连接，成功实现了高效、动态且快速响应的蛋白-蛋白通讯。作者通过设计嵌合DNA适配体，精确调控其与蛋白的结合亲和力，解决了以往研究中蛋白-蛋白相互作用不均匀、间接且多步骤的挑战。此外，LIRAC系统通过引入配体介导的变构调控，将配体诱导的构象变化转化为Cas酶的快速响应，将反应时间从传统TXTL系统的数小时缩短至仅10分钟，显著简化了系统的复杂性，开创了快速响应的蛋白通讯系统新模式。LIRAC系统展现了极高的灵敏度和可编程性，能够实现多种环境污染物的快速监测，并可通过构建三态逻辑门实现多重污染物的智能检测。基于其快速响应特性，进一步开发了便携式检测设备和试纸条，能够在现场对环境污染物进行快速分析。LIRAC系统的模块化特性使其具有广泛的应用潜力，不仅可以应用于环境污染监测，还为基因编辑和生物传感等领域提供了全新的高效策略。

清华大学陈春来教授和周书棋博士、华南农业大学刘英菊教授和敖日其冷博士、中国科学院生态环境中心王丁一助理研究员提供了帮助。

https://doi.org/10.1002/anie.202416671

制版人：十一

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