Nature重磅！耶鲁大学诞生首个单终止密码子基因组重编码大肠杆菌

图 | 通过基因重组技术，将大肠杆菌的遗传密码进行重编码，使其只剩下一个终止密码子的设计和构建过程（来源：上述论文）密码子是编码特定氨基酸的三个核苷酸序列，它就像蛋白质合成的“说明书”，告诉细胞将哪种天然氨基酸添加到不断增长的蛋白质链中，或者在三个“终止”密码子（TAG、TGA 和 TAA）的情况下，发出蛋白质合成终止的信号。

近日，来自耶鲁大学的研究团队利用合成生物学手段，描述了“Ochre”，一种将冗余密码子功能完全压缩为单个密码子的 GRO。他们创造了一种仅依赖单一终止密码子（UAA）的大肠杆菌，从而生产出新型合成蛋白质，并将冗余的 UAG 和 UGA 密码子重新定义为非标准氨基酸的编码位点。这一突破性的研究不仅推动了对遗传密码可塑性的理解，也为生物制造和合成生物学开辟了新的可能性。这项成果发表在 Nature 期刊，标题为“Engineering a genomically recoded organism with one stop codon”。

在天然系统中，基因翻译依赖三联密码子决定蛋白质的氨基酸序列，其中 TAG、TGA 和 TAA 是标准的终止信号。尽管这些终止密码子功能相同，但它们的并存仅仅是进化冗余的产物。研究团队意识到，如果能够消除这种冗余，将所有终止信号压缩至 UAA，就能释放 UAG 和 UGA 的编码能力，从而将其用于高效整合非标准氨基酸。

为了实现这一目标，研究人员采用了多重自动基因组工程（MAGE）技术，这是一种基于寡核苷酸定向突变的精确基因编辑方法。首先，他们设计了一系列短寡核苷酸，这些寡核苷酸与目标 TGA 密码子所在的基因组区域部分互补，并携带 TGA→TAA 的突变信息。通过电穿孔方式，将这些寡核苷酸导入大肠杆菌 C321.ΔA 菌株，并依靠宿主的错配修复系统进行同源重组，逐步完成 TGA 的替换。这一过程被循环多次，每次都会针对不同的基因组区域，最终完成 1195 个 TGA 密码子的全基因组替换。

图 | 通过基因重组技术，将大肠杆菌的遗传密码进行重编码，使其只剩下一个终止密码子的设计和构建过程（来源：上述论文）

此外，为了减少需要编辑的 TGA 数量，研究人员删除了 76 个非必需基因和 3 个假基因。通过基因组测序确认，最终获得的菌株中仅剩下 10 个未编辑的假基因和 8 个转座元件，标志着首个仅依赖 UAA 终止翻译的大肠杆菌的诞生。

虽然 TGA 密码子已经全部被 TAA 取代，但在天然系统中，RF2（释放因子 2）依然可以识别 UGA 并终止翻译，这可能会干扰 UGA 作为编码位点的重新定义。为了解决这一问题，研究团队对RF2 进行了精准工程化改造。

图 | 通过工程改造 RF2 以减弱 UGA 终止密码子的作用，展示了野生型 RF2.B 和突变型 RF2.B3 的 mRNA 转录本和蛋白质关键核苷酸与氨基酸的变化（来源：上述论文）

RF2 的识别特性主要由其识别环决定，该区域通过氢键和静电作用区分不同的终止密码子。研究人员引入了 S205P 突变，这一突变影响 RF2 的识别环，使其对 UGA 的亲和力显著降低。此外，他们还引入了 E170K 突变，这一突变被认为可以恢复蛋白结构的稳定性，并补偿因 S205P 导致的生长缺陷。

实验验证显示，工程化 RF2（命名为 RF2.B3）对 UGA 的识别能力降低了45 倍，使 UGA 的终止效率大幅下降，从而为 UGA 的重新编码创造了条件。同时，荧光报告系统进一步证明了这一点，在 UGA 位置，RF2.B3 的终止翻译能力明显减弱，使细胞能够高效整合非标准氨基酸。

除了释放因子的优化，研究人员还发现，天然大肠杆菌的tRNATRP（色氨酸 tRNA）具有一定的摇摆效应，即它可以错误地识别 UGA，并在 UGA 密码子位置插入色氨酸。这种误读效应主要来源于tRNA 的 A37 修饰（m1G37 修饰），该修饰增强了 tRNA 的密码子识别能力，使其在翻译过程中对 UGA 具有一定的亲和力。

为了解决这一问题，研究人员在 tRNATRP 上引入了A37G 突变，这一突变破坏了 m1G37 修饰位点，使 tRNATRP 不再错误识别 UGA。质谱分析验证了这一点，在经过 A37G 突变后的菌株中，原本高达80% 的 UGA 误读完全消失，Trp 在 UGA 位置的误读率降至 0%，从而确保了 UGA 可以作为一个真正独立的密码子用于非标准氨基酸的整合。

在解决了密码子误读和释放因子干扰的问题后，研究团队构建了一套正交翻译系统，为 UAG 和 UGA 分别设计了特定的氨酰-tRNA 合成酶：UAG 重新编码为对乙酰苯丙氨酸（pAcF）；UGA 重新编码为 Boc-赖氨酸（BocK）。

荧光报告系统显示，经过优化的菌株在UAG+UGA 双非标准氨基酸整合方面的效率提高了 20 倍，并且蛋白的翻译准确率达到 99% 以上。这一结果表明，Ochre 菌株能够精确控制密码子的翻译过程，从而为合成生物学提供了更强大的遗传编码工具。

除了遗传密码扩展能力，新型菌株还展现出卓越的生物安全性。由于该菌株不再使用 TAG 和 TGA 作为终止密码子，病毒无法通过常规的翻译机制劫持宿主细胞来复制自身。噬菌体感染实验验证了这一点：新型菌株对含 TAG 的 λ 噬菌体完全抵抗，并显著降低了含 TGA 的 μ 噬菌体感染率，这意味着其在生物安全和环境封闭系统中的应用潜力巨大。

图 | 利用噬菌体试验对释放因子变异体进行特性分析，以评估其对不同终止密码子的感染性（来源：上述论文）

上述菌株的诞生标志着非冗余遗传密码的可行性，未来，它可用于合成高度定制化的蛋白质，包括更稳定、更高效的生物制剂，并有望在生物制造和环境友好型生物技术领域发挥重要作用。研究团队正在探索更进一步的基因组优化，以创建更稳定、更高效的生物系统，让生命真正迈入可编程时代。

1.Michael W. Grome et al, Engineering a genomically recoded organism with one stop codon, Nature (2025). DOI: 10.1038/s41586-024-08501-x

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