疫苗前沿 | 基于自复制mRNA的RSV疫苗的设计与验证

新获批的呼吸道合胞病毒（RSV）亚单位和mRNA疫苗主要通过产生抗体提供超80%的保护，可有效预防疾病。而基于自扩增mRNA（saRNA）的替代疫苗技术平台有望诱导体液和细胞免疫应答，从而作为预防性RSV疫苗。2024年11月，强生疫苗研发团队在Nature Communications（IF:14.7）上发表“

A self-amplifying RNA RSV prefusion-F vaccine elicits potent immunity in pre-exposed and naïve non-human primates

发表期刊：Nature Communications

发表时间：2024年11月

影响因子：14.7

应用技术：LNP、saRNA疫苗、RSV.preF、多功能T细胞、病毒中和试验、ICS、SPICE、IFNγ ELISpot测定抗原特异性细胞应答、ELISE测定IgG/IgA滴度等实验

01

背景介绍

RSV为单股负链RNA病毒，双层脂质囊膜上含刺突，即G和F蛋白。G对宿主细胞有吸附作用，F为融合蛋白。RSV是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染，特别是婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎最重要的病原。而中和抗体诱导不良、Th2偏向的CD4+ T细胞应答、I/II型IFN反应减弱及基于动物研究的RSV感染后肺部嗜酸性粒细胞增多等因素使得有效RSV疫苗的开发变得复杂。

新生小鼠RSV感染模型显示，在初次感染期间I/II型IFN反应导致再次感染时肺部病理减少；Th1偏向的RSV.F疫苗已在动物模型中证明能克服Th2偏向，促进中和抗体和T细胞的诱导。且有研究表明RSV特异性功能T细胞减少与老年人的疾病严重程度相关。因此，有效触发体液免疫和Th1偏向型细胞免疫的RSV疫苗可能对于保护这些易感人群至关重要。

02

SMARRT.RSV.preF疫苗

的设计和体外表征

以VEEV TC83减毒株的复制子序列作为该saRNA疫苗的骨架，将表达RSV A2毒株全长、膜锚定、稳定RSV融合前F蛋白（pre-F）的序列插入骨架亚基因组启动子的下游后，用含可电离脂质ALC-0315、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000的LNP封装得到疫苗成品SMARRT.RSV.preF。此外，为规避宿主先天反应对复制子翻译的影响，在nSP-1上游插入一个称为下游环（DLP）的RNA基序（来自Sindbis病毒）。SMARRT.RSV.preF平均流体动力学粒度为75±5nm，PDI＜0.2。用抗RSV.F特异性mAb在接种疫苗24h后的BHK细胞中采用流式细胞术确认总表达和表面表达膜锚定RSV.F的细胞比例。

图1SMARRT.RSV.preF设计及体外活性

03

SMARRT.RSV.preF

在小鼠模型中的免疫原性

8只6-8周龄雌性BALB/c小鼠分别肌肉注射0.1、1和10mcg SMARRT.RSV.preF（100μL/只，每条后腿各50μL），28d后接种第二剂，阳性对照接受单剂量1010个Ad26.RSV.preF病毒颗粒。接种单剂SMARRT.RSV.preF后，小鼠血清中RSV-CL57中和抗体（VNA）和RSV-preF特异性IgG抗体呈剂量依赖型增加，且二次免疫后血清抗体均明显增加。

病毒中和实验（naïve和RSV预暴露的小鼠及食蟹猴NHP）：将动物热灭活血清样品连续稀释并与25000pfu萤火虫荧光素酶（FFL）标记的RSV-CL57混合后室温（RT）孵育1h，向每孔中加入5000个A549细胞（感染复数：5），将板置于37℃、10%CO2下孵育20h后加入Neolite底物，用Envision®读板器测量发光信号。

ELISA试验（测定小鼠和食蟹猴NHP血清中RSV preF特异性IgG抗体及NHP鼻拭子中RSV preF特异性IgA滴度）：

将涂有0.5μg/mL链霉亲和素的96孔半面积板4℃孵育过夜。用含0.05% Tween-20的PBS洗涤孔，用含1%酪蛋白的PBS缓冲液RT封闭1h。洗涤后将生物素化的2μg/mL RSV preF蛋白加入孔中RT孵育1h。洗涤后将热灭活血清样品和标准品加入孔中RT孵育1h。用HRP标记的抗小鼠IgG（1：5000）或抗猴IgA（1：5000）检测RSV preF特异性抗体。

为评估细胞应答，用RSV.F肽库刺激接种2剂10mcg SMARRT.RSV.preF的小鼠脾细胞（第56天分离），ICS结果显示SMARRT.RSV.preF诱导IFNγ+和TNFα+单功能性及IFNγ+TNFα+IL2+和IFNγ+TNFα+多功能RSV.F特异性CD8+ T细胞。且诱导低频率单功能CD4+ T细胞及IFNγ+TNFα+IL2+、IFNγ+TNFα+、TNFα+IL2α+双阳性细胞。综上，SMARRT.RSV.preF在小鼠单次免疫后具免疫原性，二次免疫可进一步增加应答。

测定方法：用来自RSV.A2、仓鼠抗小鼠CD28（1:500）和大鼠抗小鼠CD49d（1:500）的F蛋白肽库刺激脾细胞1h后加入BD GolgiPlug™。置于37℃、5% CO2下孵育4h后在4℃和5% CO2下孵育过夜。后用抗小鼠CD16/CD32抗体（1:50）阻断Fc受体，进一步用抗CD3-FITC（1:400，Clone142-2C11）、CD4-PerCpCy5.5（1:400，CloneRM4-5）和CD8-APC.H7（1:75，Clone53-6.7）对细胞进行染色。用BD Cytofix/Cytoperm™进行透化，并用IFNγ-PE（1:200，CloneXMG1.2）、TNFα-PE.Cy7（1:200，CloneMP6-XT22）和IL2-APC（1:300，CloneJES6-5H4）抗体进行胞内染色，最后用流式细胞仪对阳性细胞占比进行分析。

图2SMARRT.RSV.preF诱导小鼠体液及细胞应答

04

SMARRT.RSV.preF

在NHP中诱导体液免疫

在naïve和RSV预暴露NHP中评估SMARRT.RSV.preF的免疫原性。12只6-7岁龄的食蟹猴NHP经鼻和气管内途径感染106PFU RSV.A2或RSVMemphis37（鼻内0.1mL和气管内1mL，共计1.1mL），三个月后肌肉注射1或10mcg SMARRT.RSV.preF或在第0周接种50mcg重组RSV.preF蛋白（PRPM）；naïve对照组（n=4）在第0周接种10mcg SMARRT.RSV.preF。结果在RSV预暴露的NHP中，PRPM、1或10 mcg SMARRT.RSV.preF组第2周的记忆性VNA反应和IgG滴度较第0周显着提高，且接种后3个月间水平均明显高于接种前。naïve NHP组中，VNA反应和IgG滴度也显著增加，但明显弱于相同剂量的RSV预暴露组。

研究表明，RSV特异性黏膜IgA抗体与人及NHP的保护作用有关。故测定初次免疫后第8周收集的鼻拭子中存在的RSV.preF特异性IgA。与naïve组（1/4）相比，接种10mcg SMARRT.RSV.preF的所有RSV预暴露动物和3/4接种1mcg SMARRT.RSV.preF的动物中具可检测到的IgA抗体。综上，SMARRT.RSV.preF在RSV预暴露NHP中诱导记忆性血清学反应，并伴有鼻腔中可检测的RSV.preF IgA抗体。

图3SMARRT.RSV.preF在NHP中诱导体液免疫

05

SMARRT.RSV.preF

在NHP中诱导细胞免疫

通过IFNγ ELISpot测定从疫苗免疫后的NHP中分离的PBMC的抗原特异性细胞应答，计为每百万PBMC细胞的IFN-γ形成单位（SFU）。RSV预暴露NHP中，10mcg SMARRT.RSV.preF组的ELISpot反应相较于1mcg组峰值更高且更一致，PRPM组则未增加RSV.F特异性IFNγ ELISpot反应。naïve组第4周诱导弱于相同剂量RSV预暴露组的de-novo反应。

全身RSV.F特异性多功能T细胞与人类低再感染率相关。与ELISpot反应一致，SMARRT.RSV.preF免疫后，RSV预暴露NHP在第4周与基线相比，RSV-F特异性记忆CD4+和CD8+ T细胞增加，PRPM组则未增加。naïve组中，10mcg SMARRT.RSV.preF组记忆CD4+ T细胞略有增加，对CD8+ T细胞影响较小，且在接种相同剂量时RSV预暴露组的记忆CD4+ T细胞较naïve组增加3倍。

图4 IFNγ ELISpot及RSV.F特异性多功能T细胞测定

采用SPICE测定第4周疫苗诱导的T细胞多功能性。蛋白疫苗接种后仅1/4的记忆CD4+和CD8+ T细胞表现出多功能性，且占据主导数量的单功能细胞表型为TNF-α阳性。1mcg或10mcg SMARRT.RSV.preF组的RSV预暴露NHP显示超50%的多功能CD4+和CD8+ T细胞， 其中IFNγ+TNFα+IL2+三重阳性记忆CD4+ T细胞数量为naïve组的10倍；CD107a+IFNγ+TNFα+IL2+、CD107a+IFNγ+TNFα+和CD107a+IFNγ+细胞占RSV.F特异性CD8+ T细胞的50%，且这些多功能T细胞中分泌最多的是CD107a和IFNγ，naïve组则主要诱导CD107a和TNFα的单功能记忆CD8+ T细胞。

综上，在RSV预暴露NHP中，单剂量SMARRT.RSV.preF比RSV蛋白疫苗诱导更高水平、更高质量的多功能记忆T细胞。

图5SPICE测定T细胞多功能性

06

SMARRT.RSV.preF

诱导参与免疫细胞趋化的炎症细胞因子

疫苗接种后的早期先天免疫反应会影响适应性免疫反应。测定免疫前及免疫后24h血清中的45种分析物（炎症相关细胞因子/趋化因子）水平。PRPM免疫未导致任何分析物水平变化，与基线水平相比，1 mcg和10 mcg SMARRT.RSV.preF组免疫24h后分别有9和23个分析物水平发生变化，其中促炎分析物（如IL6、TNFα、IL18、IL15、VEGFA）和参与免疫细胞运输/调节的分析物（如CXCL9、CXCL10、CXCL11、CSF1、Flt3LG、CCL-3、4、8、11和19）水平上调；EGFR配体EGF和TGFα及在细胞迁移和血管生成中起重要作用的MMP-1和MMP-12水平下调。分析物间相关性结果显示包括IL15、CCL4、CXCL10和TNFα在内的一系列细胞因子/趋化因子在调节SMARRT.RSV.preF诱导的先天反应中具协同作用。富集物分析发现，分析物会影响干扰素（I和II型）信号通路介导的炎症相关的典型通路。

综上，SMARRT.RSV.preF诱导主要参与炎症和免疫细胞趋化的多效性细胞因子/趋化因子的剂量依赖型增加。

图6SMARRT.RSV.preF诱导的血清趋化因子/细胞因子分析

07

结语

本研究首次描述基于saRNA的RSV疫苗在naïve和RSV感染的NHP中同时具有免疫原性，并证明单剂量SMARRT.RSV.preF在小鼠和naïve/RSV预感染的NHP中诱导有效的体液和细胞应答。在RSV预暴露环境中，相较于RSV.F蛋白疫苗，SMARRT.RSV.preF诱导的体液应答能力与之相当，但显著增强了细胞应答的强度及质量。

总之，saRNA平台在naïve和预暴露个体中以相对较低的剂量诱导Th1反应和增强免疫反应的固有能力使其成为儿童和成人RSV疫苗的理想平台。

参考文献

[1] Vijayan A, Vogels R, Groppo R, Jin Y, Khan S, Van Kampen M, Jorritsma S, Boedhoe S, Baert M, van Diepen H, Kuipers H, Serroyen J, Del Valle JR, Broman A, Nguyen L, Ray S, Jarai B, Arora J, Lifton M, Mildenberg B, Morton G, Santra S, Grossman TR, Schuitemaker H, Custers J, Zahn R. A self-amplifying RNA RSV prefusion-F vaccine elicits potent immunity in pre-exposed and naïve non-human primates. Nat Commun. 2024 Nov 14;15(1):9884. doi: 10.1038/s41467-024-54289-9.

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撰写| 工程菌星球

校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice