上海
转座子占据了人类基因组一半，其过度活跃会威胁基因组稳定性。在动物生殖细胞中，piRNA（Piwi-interacting RNA）通路是抵御转座子的重要防御系统之一。piRNA与定位于细胞核或细胞质的PIWI家族蛋白结合，在转录和转录后水平沉默转座子。作为对中心法则的重要补充，细胞核定位的piRNA以及其下游蛋白能特异性介导基因组中活跃转座子的异染色质（H3K9me3）形成，进而抑制转座子表达。PIWI/piRNA如何通过转座子的新生RNA建立异染色质，是RNA介导表观遗传学调控的核心问题之一（图1）。DNA可通过直接招募HP1a（H3K9me3 reader）或者SetDB1（H3K9me3 writer）等沉默因子，介导H3K9me3异染色质的形成。原有模型简单认为，新生RNA作为“脚手架”（scaffold） 招募沉默因子，从而建立异染色质。然而，与此不同的是，新生RNA本身直接招募这些异染色质相关的沉默因子（HP1a或SedDB1），并不能有效介导转录沉默或异染色质形成。
图1. PIWI/piRNA 介导转座子异染色质形成的模型。
2025年2月26日，广州医科大学附属妇女儿童医疗中心的俞洋团队联合清华大学李丕龙团队、中国科学院生物物理研究所的高璞团队以及东南大学的罗卓娟和林承琪团队，在Molecular Cell上发表题为“Pcf11/Spt5 condensates stall RNA polymerase II to facilitate termination and piRNA-guided heterochromatin formation”的研究。该研究首先通过RNAi筛选，鉴定出piRNA介导转录沉默和异染色质形成过程中的多个关键基因。后续对筛选出的关键因子（Pcf11和PNUTS）的作用机制进行深入研究，揭示了RNA聚合酶II （Pol II） 的延伸阻滞（stalling）在piRNA介导异染色质形成过程中的重要作用。与此同时，该研究为Pcf11和PNUTS如何介导Pol II 延伸暂停这一基因转录终止中的核心功能，也提供了重要证据（图2） 。
图2. Pcf11/Spt5可通过相变引起Pol II延伸停滞，在正常基因表达过程中辅助Pol II在转录结束的位置正常终止（上图）。该特性在生殖细胞中被PIWI/piRNA介导的PANDAS复合物【1】利用，以促进转座子位点的异染色质形成和沉默（下图）。
该研究利用RNA拴住报告基因系统对piRNA通路的候选基因进行筛选，鉴定出包括Pcf11和PNUTS等多个piRNA介导转录沉默的必需基因。虽然前人的体外生化实验提示，从酵母到人都保守的经典转录终止因子Pcf11可能通过从染色质释放Pol II而促进转录终止【2】，但是这一体外观察到的现象却无法解释：为什么Pcf11在转录终止过程中是Pol II延伸停滞所必需的因子【3】？Pcf11为何仅在低dNTP浓度下才能从DNA上解离Pol II【2】？而本研究首次证明，Pcf11本身可直接导致Pol II的延伸阻滞。本研究进一步发现，Pcf11介导Pol II的延伸阻滞，需要Pcf11蛋白内部一段可介导相变的α螺旋区域。此α螺旋区域介导相变以及Pol II延伸停滞的功能可被来自植物FCA蛋白的一段无序区域（IDR）替代。令人惊奇的是，嵌合有部分植物蛋白IDR序列的Pcf11-FCA，与果蝇野生型Pcf11类似，能几乎完全替代内源Pcf11的大多数生物学功能，包括支持果蝇基本的生存和生殖能力。
Pol II 转录终止调控是基因表达的核心生物学过程之一。通常认为，Pol II-CTD 的 Ser2 磷酸化修饰 （Ser2P） 是转录终止的重要标志。但是，Ser2P 在 Pol II转录延伸阶段也高度富集，且与 Pol II 延伸速率并无直接对应关系。另外，结构生物学研究表明， Ser2P 修饰并不参与 Pol II-CTD和Pcf11-CID结构域的结合【4】。控制Pol II转录Pausing的DSIF 复合物有Spt5和Spt4两个蛋白组成【5】。本研究首次证明，Spt5的CTR结构域可能类似于Pol II-CTD，能特异的结合Pcf11-CID 。Pol II在基因内部正常延伸时，其延伸速度较快，Spt5-CTR处于过度磷酸化的状态 （包括CTR-T4P修饰） ，而此时Pol II-CTD的T4磷酸化并不明显。与此对应的是，在转录终止过程中Pol II的延伸速度较慢，且Spt5-CTR-T4P修饰被PNUTS/PP1去磷酸化，而Pol II-CTD则富集T4磷酸化修饰 （T4P） 。以此为启发，本研究证明去磷酸化的Spt5-CTR与过度磷酸化的Pol II-CTD-T4P一起，可共同促进Pcf11相变，从而导致Pol II转录延伸的阻滞，最终辅助Pol II在基因末端 （termination zone） 通过“Sitting-duck Torpedo”模型【6】完成正常基因的转录终止。
综上，Pcf11/Spt5凝聚体通过相变阻滞Pol II延伸，从而帮助正常基因转录终止。这种机制在生殖细胞中，以某种未知方式被piRNA通路的PANDAS复合物利用，来阻滞转座子的Pol II延伸。Pol II阻滞后，可使得转座子位点的新生RNA变为更加“稳定”的脚手架，以利于转座子周围染色质的表观遗传修饰和H3K9me3异染色质的建立（见图2）。有意思的是，在人类细胞中抑制NXF1的功能 （类似于果蝇中NXF2 结合NXF1并形成PANDAS复合物【1】） ，同样可以抑制Pol II转录延伸并促进提前转录终止 （premature termination）【7】。在植物和酵母中，也存在通过阻滞Pol II延伸来调控表观遗传的类似现象【8,9】。因此，阻滞Pol II延伸很可能是RNA调控表观遗传所必需的且在各物种中普遍保守的分子机制。
俞洋、李丕龙、高璞和罗卓娟为本文的共同通讯作者；俞洋团队科研人员刘炜炜和王明，博士生邓丽君，刘肖君和欧阳轩，以及李丕龙团队的博士生汪源为本文共同第一作者。除各实验室团队的其他成员外，本研究还得到复旦大学的徐彦辉、陈飞和王振宁，清华大学的陈春来和张亚迪，以及穗妇儿的李卫和刘超等科研人员以及生物物理所科研平台的大力支持。该工作也得到朱冰、张宏和杨延钟等科学家的中肯建议。
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.01.023
https://authors.elsevier.com/a/1kgT53vVUPVZU1
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[2] Z. Zhang and D. S. Gilmour, "Pcf11 is a termination factor in Drosophila that dismantles the elongation complex by bridging the CTD of RNA polymerase II to the nascent transcript," Mol Cell, vol. 21, no. 1, pp. 65-74, Jan 6 2006, doi: 10.1016/j.molcel.2005.11.002.
[3] Z. Zhang, J. Fu, and D. S. Gilmour, "CTD-dependent dismantling of the RNA polymerase II elongation complex by the pre-mRNA 3'-end processing factor, Pcf11," Genes Dev, vol. 19, no. 13, pp. 1572-80, Jul 1 2005, doi: 10.1101/gad.1296305.
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[6] M. A. Cortazar et al., "Control of RNA Pol II Speed by PNUTS-PP1 and Spt5 Dephosphorylation Facilitates Termination by a "Sitting Duck Torpedo" Mechanism," Mol Cell, vol. 76, no. 6, pp. 896-908 e4, Dec 19 2019, doi: 10.1016/j.molcel.2019.09.031.
[7] S. Chen et al., "The mRNA Export Receptor NXF1 Coordinates Transcriptional Dynamics, Alternative Polyadenylation, and mRNA Export," Mol Cell, vol. 74, no. 1, pp. 118-131 e7, Apr 4 2019, doi: 10.1016/j.molcel.2019.01.026.
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