T-2毒素是一种由三线镰刀菌、拟枝孢镰刀菌和梨孢镰刀菌等特定菌株产生的次级代谢产物,作为A类单端孢霉烯中毒性最强的毒素,它广泛污染于玉米、小麦和大豆等谷物中。T-2毒素可造成神经毒性、免疫毒性和生殖毒性等危害。
目前,用于检测T-2毒素的方法主要有仪器分析法和免疫分析法。基于胶体金的免疫层析法(ICA)应用最为广泛。近些年来,各种新型纳米材料不断涌现,以提高ICA检测灵敏度。过渡金属碳化物因其高熔点、强硬度和良好的化学稳定性等独特优点,在冶金、电子等领域得到了广泛应用。其中,碳化钒表面呈黑色金属光泽,具有较高的信噪比、良好的耐腐蚀性和热稳定性,同时,它还具备高耐磨性和电催化活性,表现出与贵金属相似的活性。由于这些出色的性能,碳化钒广泛应用于工业生产中。
河南农业大学食品科学技术学院的罗昌伟、陈晓阳、补彤*等研究通过简单的超声辅助-液相剥离法合成碳化钒纳米片(VCNSs)作为标记材料,基于实验室制备的T-2单克隆抗体(T-2-mAb)为识别分子,采用静电吸附法制备VCNSs-mAb探针。优化实验参数得到最佳检测条件,构建玉米中T-2毒素高灵敏检测的碳化钒免疫分析方法(VCNSs-ICA)。
1 T-2-mAb的活性
本研究通过ELISA测定T-2-mAb效价和亲和力。由图2A可知,T-2-mAb效价为1.2×105,符合mAb制备要求。此外,通过图2B及式(1)计算得出,T-2-mAb的ka平均值为1.30×108 L/mol,表明该mAb具有较高的亲和力。
2 VCNSs/VCNSs-mAb探针的合成及表征
本研究通过超声辅助-液相剥离法合成VCNSs。如图3A、B所示,制备的VCNSs呈片状结构,片径为(50.00±5.12)nm(n=100)。通过紫外表征,如图3C所示,VCNSs在280 nm波长处无特征吸收峰,与T-2-mAb结合后,在280 nm波长处出现抗体的特征峰。此外,如图3D所示,当VCNSs与抗体静电吸附后,其Zeta电位值从-32.64 mV变化为-17.53 mV。这些结果均可证明VCNSs与抗体成 功偶联。
3 VCNSs-ICA制备条件优化结果
为了实现VCNSs-ICA的高灵敏度检测,本研究对包被抗原质量浓度、抗体标记量、探针添加量和检测时间进行优化。由图4A可知,当包被抗原质量浓度为2 mg/mL时,抑制率最高且显色情况良好,包被抗原质量浓度过高或过低均会影响灵敏度和显色情况。由图4B可知,当抗体添加量为12 μg时,抑制率最高且显色良好。标记适量的抗体,有利于增强VCNSs-mAb探针结构稳定性。由图4C可知,当探针添加量为4 μL时,抑制率最高。随着探针添加量增加,T线颜色逐渐加深,但探针过量时会导致灵敏度降低。为满足快速检测的时间需求(<15 min),本研究选取6、8、10、12 min对时间进行优化。如图4D所示,当检测时间为10 min时,抑制率最高。检测时间过短时,T线显色较弱影响视觉判断,时间过长同样会导致灵敏度下降。综上所述,本研究最终选取包被抗原质量浓度2 mg/mL、抗体标记量12 μg、探针添加量4 μL、检测时间10 min为最佳反应条件。
4 VCNSs-ICA性能测定结果
基于以上优化条件,本研究使用PBST将T-2标准品稀释不同质量浓度至0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3 ng/mL,根据试纸条T线检测结果和T-2标准品质量浓度,绘制标准曲线。如图5A、B所示,本研究建立的VCNSs-ICA的VDL为0.25 ng/mL,cut-off值为1.5 ng/mL。同时,经拟合数据显示,IC50为0.344 ng/mL,LOD为0.08 ng/mL,灵敏度较实验室前期制备的胶体金试纸条提高了5.6 倍。在0.14~0.78 ng/mL的检测范围内具有良好的线性关系,回归方程为Y=-74.83lg X+20.69( R2 =0.996)。由表1可知,与已报道的T-2毒素检测方法相比,该方法中LOD展现出优异的性能。此外,选取几种常见真菌毒素,包括FB1、OTA、PAT、NIV和DON进行特异性测定。如图5C所示,VCNSs-ICA对1.5 ng/mL的T-2标准品的检测结果为阳性,而对高质量浓度(100 ng/mL)的其他5 种真菌毒素的检测结果为阴性。表明该试纸条的特异性良好,与所测5 种真菌毒素均无交叉反应。
5 回收率
本研究选用玉米作为样品进行添加回收实验。T-2毒素添加量为10、20、40 μg/kg,结果如表2所示,加标回收率在92.8%~117.2%之间,变异系数均不大于9.13%。此外,通过测量20 份玉米样品可得LOD值为5.06 μg/kg。
结论
本研究成功合成VCNSs,与抗体偶联后作为信号探针,构建VCNSs-ICA免疫层析方法。通过优化一系列实验参数,从而确定最佳实验条件,成功应用于玉米中T-2毒素的快速检测。结果表明,在0.14~0.78 ng/mL的范围内具有良好的线性关系,回归方程为Y=-74.83lg X+20.69(R2=0.996)。此外,在玉米中LOD为5.06 μg/kg,加标回收率在92.8%~117.2%之间,变异系数均不大于9.13%。可见,本研究构建的VCNSs-ICA试纸条具有灵敏准确、操作简便和成本低等优点,为玉米中T-2毒素的现场快速检测提供了一定的技术支撑。
作者简介
1
第一作者
罗昌伟 硕士研究生
罗昌伟,主要研究方向为食品安全快速检测。
2
通信作者
补彤 副研究员
补彤,博士,主要研究方向为食品安全快速检测。
本文《富二十二碳六烯酸-磷脂酰丝氨酸缓解环磷酰胺导致的小鼠肾损伤机制》来源于《食品科学》2024年45卷第13期153-163页,作者:张园蕾,张红蕾,董佳昱,姜 苏,唐云平 *。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231020-159.http://www.spkx.net.cn点击下方 阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑:申婧婧 ;责任编辑:张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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