《食品科学》：合肥工业大学李兴江教授等：酱油曲发酵过程中微生物群落演替及其与挥发性风味物质的相关性

酱油主要是由米曲霉、黑曲霉等主要功能微生物分泌蛋白酶、糖化酶、淀粉酶等关键酶，将大豆蛋白、淀粉及脂肪等原料分解，最终形成色、香、味俱全的调味品。发酵是酱油生产的重要过程，包括制曲发酵和酱醪发酵两个主要阶段。针对制曲发酵过程中微生物群落及挥发性代谢物的动态变化开展研究能够丰富制曲发酵的研究基础，促进制曲技术及酱油曲品质的稳定，从而推动酱油制曲技术的发展。

合肥工业大学食品与生物工程学院韩月婷、蔡静、李兴江*等通过高通量测序技术解析酱油制曲发酵过程中微生物群落的演替情况，动态监测总酸、水分、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶及挥发性风味物质的变化情况，并探究微生物演替与其他指标之间所存在的潜在关系，全面总结制曲发酵过程中的动态变化规律，以期为酱油制曲发酵生产技术的发展提供理论指导。

01

酱油曲发酵过程中水分、总酸含量的动态变化

由图1可知，随着发酵时间的延长，水分含量持续下降，降低速度逐渐加快，并在48 h水分质量分数降到最低（28.34%）。制曲初始阶段足够的含水量能够缩短米曲霉孢子发芽时间，由于接种的曲精在发酵初期处于休眠体状态，随着发酵时间延长，米曲霉等微生物快速增长，水分含量在成曲时保持较低含量。总酸含量在发酵前期0～24 h迅速增加，由0.34%快速增加至1.68%，发酵后期缓慢增加，在48 h成曲时达到最大值2.06%。总酸的变化趋势可能由水分含量的变化引起的，发酵后期酱油曲中水分含量减少影响了产酸微生物的生命代谢活动，酸性物质可能会在此阶段挥发。曲中适当的酸度能够抑制有害杂菌，也为有益微生物提供某些生化反应的前体物质。

02

酱油曲发酵过程关键酶活力的动态变化

由图2可知，随发酵时间延长，3 种蛋白酶、糖化酶和淀粉酶活力整体趋势增加，并都在成曲48 h达到最大值，分别为酸性蛋白酶活力293.28 U/g、碱性蛋白酶活力513.59 U/g、中性蛋白酶活力834.51 U/g、糖化酶活力2 467.37 U/g及淀粉酶活力1 395.29 U/g。总体来看，在整个发酵过程中，5 种酶活力的整体趋势都增加，3 种蛋白酶活力的大小为：中性蛋白酶＞碱性蛋白酶＞酸性蛋白酶，这可能与酱油曲的原料以及接种的米曲霉有关，米曲霉主产中性、碱性蛋白酶，少量产酸性蛋白酶，蛋白酶活力的高低决定了酿造过程中蛋白质的利用率，进而决定最终产品的风味、色泽和口感。

03

酱油曲发酵过程挥发性风味物质分析

在酱油曲发酵过程中共检测出了69 种挥发性风味物质，根据化学结构可分为9 类，包括醇类9 种、醛类12 种、酮类8 种、酯类20 种、吡嗪类5 种、呋喃类1 种、酸类4 种、苯（酚）类4 种、其他杂环类6 种。如图3A所示，随着发酵时间的延长，醇类、醛类、酮类和酸类的含量先增加后减少，并都在24 h达到最大值，分别为1 212.72、1 993.80、502.86、544.42 μg/100 g。酮类含量降低，是因为酮类作为中间化合物不稳定，易被还原成醇。酯类含量随着发酵时间的延长逐渐增加，并在48 h达到最大值1 024.14 μg/100 g。在24 h出现了吡嗪类化合物，并随着发酵时间的延长而增加。另外，成曲48 h相比其他发酵时间，吡嗪类、苯（酚）类物质含量都相对较高，分别为216.94、243.85 μg/100 g。在酱油曲发酵阶段，醇类和醛类含量始终较高，是酱油曲样品中的主要挥发性风味物质。醇类通过碳水化合物糖酵解产生，发酵24 h醇类含量最高，这与酵母菌和细菌的生长消耗大量还原糖有关；醛类由支链氨基酸在真菌、酶等作用下产生。挥发性风味物质的总含量整体趋势增加，成曲48 h挥发性风味物质总含量为4 381.31 μg/100 g。酱油曲料挥发性风味物质的含量变化趋势与微生物的代谢有关。

通过PLS-DA各时间组别主要分布在3 个不同的区域，其中0 h和12 h组聚集在一起，24 h和36 h组聚集在一起，48 h组单独聚集（图3B），本次分析中自变量拟合指数（

R

2 x ）为0.919，因变量拟合指数（

R

2

Y

）为0.983，模型预测指数（

Q

2）为0.972，

R

2和

Q

2超过0.5表示模型拟合结果可接受。如图3C所示，经过200 次置换检验，

Q

2回归线与纵轴的相交点小于0，说明模型不存在过拟合，模型验证有效，认为该结果可用于酱油曲不同发酵时间挥发性风味物质的鉴别分析。为了找到制曲发酵过程中的差异挥发性风味物质，依据

P

＜0.05、 VIP＞1的标准筛选出31 种挥发性风味物质。如图3D所示，筛选出的31 种差异挥发性风味物质主要在发酵后期24～48 h含量较高。24 h含量较高的有9 种，包括2,3-丁二醇、苯乙醛、3-羟基-2-丁酮等，36 h含量较高的有醋酸乙烯酯、乙酸异戊酯、苯甲酸甲酯、苯乙酮4 种风味物质，48 h有18 种含量较为突出的风味物质，包括2 种醛类（正己醛、异戊醛）、8 种酯类（亚油酸乙酯、棕榈酸甲酯等）、4 种吡嗪类（2,5-二甲基吡嗪、2-甲基-6-乙烯基吡嗪等），以及2 种酸类物质（棕榈酸、5-甲基-2-苯基-2-己烯酸）和2 种苯（酚）类物质（2-甲氧基-4-乙烯苯酚、甲苯）。因此，可以看到成曲48 h差异风味物质种类较多，且酯类种类、含量均较多。酯类是酱油中含量最丰富之一，但酱油曲中的酯类化合物的组成与酱醪中的酯类化合物的组成明显不同，是由于制曲发酵时间短，而大部分酯类是在酱醪长期发酵（3～6 个月）中产生。

04

酱油曲发酵过程中微生物的动态变化

4.1微生物α多样性分析

对30 个酱油曲样品进行了16S rDNA、ITS高通量测序分别获得了743 108、1 177 389 条优化序列，平均序列长度为428、200 bp，高通量序列覆盖率大于99%，表示结果可靠。本研究通过Chao、ACE、Shannon和Simpson 4 个多样性指数评价酱油曲发酵过程中的细菌和真菌群落的丰度和多样性，其中Chao和ACE指数表示物种的丰度，Shannon和Simpson指数表示群落的多样性，另外，微生物群落的复杂性与Chao、ACE、Shannon指数呈正相关，与Simpson指数呈负相关。由表1可知，在整个发酵阶段，细菌的丰度和多样性在0 h最高，并随着发酵时间的延长，整体呈现先减少后增加的趋势，细菌丰度在24～48 h呈较稳定的趋势，而多样性则从12～48 h保持增加的趋势，表明细菌群落随着发酵时间增加变得复杂。真菌的丰度也在0 h最高，在0～12 h丰度降低，多样性则增加，而在后期发酵阶段12～48 h真菌丰度和多样性呈较稳定的趋势。细菌的丰度和多样性以及真菌的丰度在0 h时均为最高，主要是来自混合制曲后接种的曲精，而随着发酵时间的延长，微生物受到环境因素的影响，优势菌群快速生长，抑制其他菌群，从而影响了微生物的丰度和多样性。

4.2 微生物群落结构分析

在门水平有4 个细菌门相对丰度大于1%，分别是厚壁菌门（Firmicutes）、蓝菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）（图4A）。在整个发酵阶段，厚壁菌门（Firmicutes）占绝对主导优势（相对丰度89.03%～99.27%）。随着发酵时间的延长，蓝菌门（Cyanobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度先减少后增加，但整体趋势逐渐降低。放线菌门相对丰度增加，在36 h相对丰度最高（1.18%）。与此同时，如图4B所示，整个发酵阶段相对丰度大于1%的真菌只有子囊菌门（Ascomycota）占绝对优势（相对丰度99.14%～99.96%）。

与门水平的分类不同，酱油曲发酵在属水平上有着明显的差异。细菌相对丰度超过1%的共有10 个属（图4C），丰度前5的是威斯氏菌属（

Weissella

）、葡萄球菌属（

Staphylococcus

）、巨大球菌属（

Macrococcus

）、明串珠菌属（

Leuconostoc

）和乳杆菌属（

Lactobacillus

）。其中

Weissella

在整个发酵阶段都占据主导地位，其相对丰度的整体趋势增加， 0 h 时为 37.1 % ， 48 h 时为 70.05 % 。

Staphylococcus

是酱油曲中的另一优势菌属，在曲发酵过程中其相对丰度先减少后增加，将作为后期高盐厌氧环境酱醪发酵的优势微生物菌属。

Macrococcus

相对丰度随发酵时间延长而降低，在成曲 48 h 小于 1 % 。

Leuconostoc

相对丰度在发酵后期 12 ～ 48 h 减少。

Lactobacillus

相对丰度随发酵时间的延长而增加，在 48 h 达到最大值 8.22 % 。

真菌相对丰度大于1%主要有3 个属（图4D），分别是柯达酵母菌属（

Kodamaea

）、曲霉属（

Aspergillus

）、假丝酵母菌属（

Candida

）。酱油曲发酵阶段占主导地位的优势属是

Kodamaea

（ 48.11 % ～ 80.66 % ） 、

Aspergillus

（12.85%～97.87%）。

Kodamaea

相对丰度总体趋势增加，在成曲时的相对丰度为48.11%。

Aspergillus

的相对丰度整体趋势减少，成曲48 h的相对丰度为47.94%。

Candida

相对丰度先增加后减少。

Aspergillus

在制曲发酵和酱醪发酵前期阶段比较丰富，随着发酵的进行而降低，酵母相对丰度则增加。制曲发酵阶段酵母菌、曲霉属的扩大培养作为前期的优势菌属，可成为后续的酱醪发酵的风味优势菌。

05

相关性分析

5.1优势微生物与差异挥发性风味物质的相关性分析

为了进一步明确微生物群落与挥发性风味物质之间的关系，选取了属水平相对丰度排在前5 位的细菌和前3 位的真菌，并将这8 个微生物与筛选出的31 个差异挥发性风味物质进行Spearman相关性分析。通过筛选|

r

|＞0.5、

P

＜0.05，发现差异挥发性风味物质与微生物共有71 个成对相关，与细菌成对相关的有46 个，与真菌成对相关的有25 个，绘制相关性网络如图5所示，其中紫色实线表示正相关，绿色虚线表示负相关。

Macrococcus

与31 个差异挥发性风味物质，以及正己醛、醋酸乙烯酯与8 个微生物属均没有显著相关性，因此在网络图中没有体现。

如图5所示，细菌与大多数挥发性风味物质有显著的正相关性。

Lactobacillus

与 2,3- 丁二醇、苯乙醛、苯乙酮、油酸乙酯、 2,6- 二乙基吡嗪、棕榈酸等 26 个挥发性风味物质正相关，其中与酯类的相关性最高。

Leuconostoc

则与大部分挥发性风味物质呈负相关。

Weissella

与 3- 羟基 -2- 丁酮（

r

＝ 0.59 ）、苯甲酸乙酯（

r

＝ 0.71 ）呈正相关，与甲苯呈负相关（

r

＝－ 0.64 ）。

Staphylococcus

与甲苯呈正相关（

r

＝ 0.59 ），与苯甲酸乙酯呈负相关（

r

＝－ 0.66 ）。真菌与挥发性风味物质的相关分析中，连接数较多的是

Kodamaea

Aspergillus

。其中

Kodamaea

与 2,3- 丁二醇、苯乙醛、苯甲酸乙酯等 12 个挥发性风味物质呈显著正相关，而

Aspergillus

与 2,3- 丁二醇、苯乙醛、苯甲酸乙酯等 9 种挥发性风味物质呈负相关，与甲苯呈显著正相关（

r

＝ 0.71 ）。

Candida

与苯甲酸乙酯呈正相关，与甲 苯呈负相关。

由图4C、D可知，这两种微生物属在制曲发酵过程中整体趋势减少。但

Aspergillus

作为前期优势菌，可将酱油曲中蛋白质、淀粉等物质水解为多种氨基酸、多肽类、糖类等呈味物质，并为其他微生物提供碳源、氮源。

5.2 优势微生物与水分、总酸、酶活力的相关性分析

为进一步明确酱油曲发酵过程中微生物与水分、总酸、酶活力的相关性，选取优势微生物与水分、总酸、5 种酶活力作Mantel test检验和Spearman相关性分析。筛选

P

＜ 0.05 绘制网络图，结果如图 6 所示，网络连线越粗表示相关性越强，热图的颜色梯度表示 Spearman 相关系数。

如图6所示，相关性热图中3 种蛋白酶、糖化酶、淀粉酶均与水分呈显著负相关（

P

＜ 0.05 ），与总酸呈显著正相关（

P

＜ 0.05 ），总酸与水分呈显著负相关（

P

＜ 0.05 ）。由网络图可知，细菌中的

Weissella

Macrococcus

和真菌中的

Kodamaea

Candida

均与总酸、糖化酶相关性较大。

Lactobacillus

与酸性蛋白酶（

r

＝ 0.55 ）、总酸（

r

＝ 0.82 ）、糖化酶（

r

＝ 0.55 ）、淀粉酶（

r

＝ 0.56 ）的相关性较大。

Weissella

Lactobacillus

作为乳酸菌的一种，在制曲发酵阶段进行乳酸发酵，分泌多种酶类，作为曲霉酶系的补充，促进原料水解，在后续酱醪发酵中可以通过产细菌素、产酸的方式来抑制杂菌的生长。酱油曲中总酸与多个优势微生物有关，从而影响微生物群落 α 多样性指数的变化。

Kodamaea

Candida

作为酵母菌分泌糖化酶，分解淀粉供酵母发酵，将碳水化合物转化为乙醇的同时产生多种酯类、呋喃酮等风味物质。微生物的代谢活动促进酶活力增加的同时有利于酶分解曲原料，产生丰富的代谢物质，为酱油 后续发酵提供了较强酶活力和初级代谢物。

结论

酱油制曲发酵阶段丰富的微生物资源对酱油曲的品质以及挥发性风味物质的形成有着重要的影响。随着发酵时间的延长，酱油曲中水分含量减少，总酸和5 种酶活力增加。3 种蛋白酶中酸性蛋白酶活力最低，中性蛋白酶活力最高。酱油曲整个发酵过程中共检测出69 种挥发性风味物质，以醇类、醛类为主，其中2,3-丁二醇、苯乙醛、亚油酸乙酯、2,6-二乙基吡嗪等31 个差异挥发性风味物质对酱油曲发酵过程阶段划分具有重要意义。整个发酵阶段，优势细菌有

Weissella

Staphylococcus

Lactobacillus

等，其中

Lactobacillus

的相对丰度随发酵时间的延长而增加，同时有助于酱油曲的挥发性风味物质的形成；优势真菌有

Kodamaea

Aspergillus

Candida

，其中

Kodamaea

与多种挥发性风味物质具有强相关性，可作为后期酱醪发酵主产风味物质的微生物。总酸显著影响了优势微生物丰度的变化，同时对主要酶系有较强相关性。本研究为调控和提高酱油曲品质提供参考，对酱 油制曲的发展及后续应用具有重要意义。

作者简介

通信作者：

李兴江，1978年，男，中共党员，博士，教授，博士生导师，自2004年毕业留校于合肥工业大学食品与生物工程学院工作至今，主要围绕发酵食品微生物代谢调控共性技术开展研究，主持国家与地方财政纵向项目合计经费2500万，其中国家级项目9 项（含国家基金2 项、国家重点研发子课题1 项、国家星火计划等）、省重大专项4 项、地方揭榜挂帅3 项，发表SCI通讯论文50余篇（其中TOP论文25 篇），第一发明人授权专利10 件（其中3 件专利转让350 万），牵头省科技进步二等奖2 项（分别排名第1、第2）。

发酵技术国家工程研究中心副主任（2012-至今），安徽省即食发酵制品工程研究中心主任（2022-至今），安徽省高端领军人才特聘教授（2023-至今），安徽省科技厅“生物与育种领域”咨询与评审专家委员会主任（2023-至今），安徽省科技厅“发酵食品领域”指南与会评专家组组长（2022-至今），国家自然基金（青年、面上、优青）函评专家、国家重点研发计划函评及会评专家。

第一作者：

韩月婷，女，中共党员。 合肥工业大学食品科学与工程专业学术硕士 。户籍安徽合肥。

本文《酱油曲发酵过程中微生物群落演替及其与挥发性风味物质的相关性》来源于《食品科学》2024年45卷第19期57-64页，作者：韩月婷，蔡 静，邱鹤翔，吴学凤，刘兰花，穆冬冬，李兴江。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231129-254。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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