《食品科学》：北京工商大学李秀婷教授等：3种高温大曲功能特征与微生物群落结构差异性分析

高温大曲是酱香型白酒生产酿造的基础，各轮次发酵均需加入且用量大，与酱香型白酒独特的酱香味的形成关系密切。高温大曲功能品质受原料配方、制曲工艺、生产以及贮存发酵环境如曲房温湿度、房内堆叠形式、曲块所处位置等各方面因素的影响，而制曲环境的差异使得成品曲具有明显的颜色特征，因此生产中按颜色将高温大曲分为白曲、黄曲和黑曲3 种类别。 目前，较多研究者关注到不同来源的高温大曲微生物群落结构组成存在差异。

北京工商大学食品与健康学院的梁二宏、李金洋、李秀婷*等本研究采用高通量测序技术及顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）联用技术对产自贵州同一生产厂家的3 种不同颜色高温大曲的理化性质、风味化合物及微生物群落进行对比分析， 揭示3 种大曲之间品质差异的根本原因，Spearman相关性分析微生物与风味代谢途径之间的潜在联系，系统解析不同颜色高温大曲之间的性能特征差异根源，以期为其在酱酒生产中的合理使用提供重要基础数据。

1 3 种高温大曲理化指标对比分析

水分含量、淀粉含量、酸度等理化指标可在一定程度上说明大曲品质优劣。 一般来说，液化力、糖化力、酯化力等间接指示着大曲的酶系功能，发酵力的大小则可表明大曲中某些微生物生长能力，白酒生产中通常依据理化指标等参数来判断大曲是否适合发酵。 图1显示了3 种高温大曲理化指标的对比，黑曲的水分质量分数（（0.10±0.25）%）最高，白曲的水分质量分数（（0.07±0.03）%）最低，这可能是曲房中储存位置的不同而通风条件差异所导致，白曲位于外层，通风条件好而水分流失较多，黑曲位于内层则水分流失较少[ 实际生产中通常要求大曲水分质量分数不应超过13.0%，所试样品的水分质量分数均符合要求。 大曲具有一定酸度主要是由于乳酸菌和其他产酸微生物的有机酸代谢以及脂肪、淀粉和蛋白质的降解，分析样品中，黑曲（（2.17±0.06）mmol/10 g）的酸度高于黄曲（（1.70±0.10）mmol/10 g）和白曲（（1.70±0.20）mmol/10 g）。 大曲的淀粉含量反映的是其在贮存发酵过程中微生物消耗淀粉的水平，糖化力和液化力代表大曲中微生物将淀粉转化为葡萄糖的能力。 分析结果表明，黄曲（0.74±0.07）%）的淀粉质量分数居首，明显高于黑曲（（0.39±0.07）%）和白曲（0.69±0.07）%），而黄曲则表现出最低的糖化力（（74.67±3.06）U）和发酵力（（0.04±0.01）U）。 结合微生物多样性分析（图2）可发现，3 类大曲中，具有糖化代谢功能的核心微生物Bacillus丰度在黄曲中处于最低水平，而Bacillus能产生淀粉酶、葡糖淀粉酶和葡萄糖苷酶等淀粉降解酶，这应该是黄曲的糖化力和发酵力最低的主要原因。 大曲的酯化力与白酒中己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯等酯类化合物的形成有关。 其中白曲的酯化力（（128.75±4.34）U）最高。综合来看，3 种大曲的理化指标差异性显著，且与其微生物群落组成和丰度差异相关。

2 3 种大曲挥发性风味成分差异性

一般地，大曲风味成分是白酒香味物质的来源或前体物，直接或间接地影响着白酒发酵过程物质的形成，进而对白酒的风味产生重要影响。3 种大曲中共鉴定出56 种挥发性风味物质，依据化学结构分为9 类，包括酯类（12 种）、醇类（10 种）、酸类（3 种）、醛类（7 种）、酮类（4 种）、酚类（3 种）、醚类（3 种）、呋喃类（1 种）和其他成分（13 种）。其中，黑曲含40 种，白曲含40 种，黄曲含39 种。3 种大曲中挥发性物质含量存在明显差异。如图3所示，酯类和醇类分别占大曲总成分的17%～20%和26%～35%。黄曲和黑曲中乙酸乙酯的含量水平明显高于白曲，分别为（3.33±2.14）、（2.79±0.13）μg/kg和（1.64±0.59）μg/kg。同样，黄曲（（12.99±4.98）μg/kg）和黑曲（（15.28±2.97）μg/kg）中的己酸乙酯含量明显高于白曲（（5.42±1.25）μg/kg）。黑曲中乙醇含量（（35.3±6.01）μg/kg）最高，明显高于白曲（（18.55±3.56）μg/kg）和黄曲（（19.32±6.36）μg/kg）。黄曲（（2.65±0.76）μg/kg）和黑曲（（3.03±0.82）μg/kg）中的1-己醇含量明显高于白曲（（1.55±0.59）μg/kg）。黄曲（（12.58±4.23）μg/kg）和黑曲（（11.25±1.18）μg/kg）中的苯乙醇含量明显高于白曲（（8.88±2.12）μg/kg）。此外，黄曲中糠醛（（13.99±6.31）μg/kg）、安息香醛（（11.39±4.38）μg/kg）、椰子醛（（1.17±0.39）μg/kg）的含量高于其他2 种大曲（表1）。总体上，不同种类大曲中的挥发性化合物的含量显示出明显的差异性。大曲中的挥发性化合物会直接影响白酒的香气特征，曲香是白酒风味的重要组成部分。具有果香和花香的酯类是白酒风味轮廓的重要贡献者，而以己酸乙酯等为主的酯类化合物中在黑曲和黄曲中的含量高于白曲；在白酒中含量很丰富，且与其他物质相配比以决定白酒风格类型的醇类化合物，如浓郁优雅的花香的1-己醇、麦芽香的异戊醇、玫瑰和蜂蜜香的苯乙醇以及杏仁和玫瑰花香的苯甲醇均在3 种大曲中检出且存在浓度差异。此外，大曲中还检出7 种醛类物质，如有杏仁和甜味的糠醛等，各种风味成分的组合构成大曲的风味功能特征。

3 3 种大曲微生物群落结构组成与相互作用

大曲中挥发性风味物质的形成受多种代谢反应及复杂微生物群落的驱动及影响。本研究结果表明3 种大曲中，细菌16S rDNA片段的有效读数为892 111～991 941 bp，真菌ITS DNA片段的有效读数为755 281～812 211 bp。Coverage指数显示所有样品的覆盖率均达到99.9%，表明样品足够反映大曲样品中微生物组成的真实情况。细菌群落方面，黄曲中细菌的物种丰富度和多样性明显高于黑曲和白曲；真菌群落方面，白曲中真菌的物种丰富度和多样性都明显高于黑曲和黄曲。此外，3 种大曲细菌的物种丰富度和多样性都超过真菌。

为确定大曲中微生物群落结构组成差异，分别于门水平、属水平及种水平分类分析。结果表明，大曲中Firmicutes、Actinobacteriota和Proteobacteria是最主要的细菌门，Firmicutes的相对丰度最高（图2A），分别为黑曲97.33%、白曲87.95%和黄曲58.18%。Actinobacteriota在黄曲（25.16%）中的相对丰度明显高于白曲（11.36%）和黑曲（1.51%）。细菌属水平上，Bacillus和Scopulibacillus在大曲中均占主导地位。黑曲中，主要优势菌属是Bacillus（33.36%）、Scopulibacillus（31.67%）、Virgibacillus（24.55%）和Saccharopolyspora（1.02%）；白曲中，主要优势细菌属是Bacillus（40.03%）、Thermoactinomyces（18.10%）、Weissella（12.50%）、Scopulibacillus（9.59%）、Saccharopolyspora（8.64%）、Kroppenstedtia（3.08%）、norank_f__Pseudonocardiaceae（2.56%）和Virgibacillus（1.08%）；黄曲中，主要优势菌属是Saccharopolyspora（18.03%）、Klebsiella（14.75%）、Bacillus（13.10%）、Oceanobacillus（10.48%）、Scopulibacillus（9.68%）、Thermoactinomyces（7.10%）、norank_f__Pseudonocardiaceae（5.64%）、Virgibacillus（5.62%）、Kroppenstedtia（4.72%）和Weissella（1.90%）（图2C）。

真菌门水平上，Ascomycota相对丰度分别为黑曲99.99%、白曲99.98%和黄曲99.98%（图2B）。属水平上，Thermomyces在3 种大曲中相对丰度分别为黑曲56.15%、白曲78.82%和黄曲50.29%；Thermoascus在3 种大曲中分别为黑曲36.95%、白曲21.07%和黄曲13.32%；Aspergillus在3 大曲中相对丰度分别为黑曲6.06%、白曲0.29%和黄曲36.28%（图2D）。Phialosimplex在黑曲中相对丰度为0.72%，Saccharomycopsis在白曲中相对丰度为0.52%，Byssochlamys在白曲中相对丰度为0.23%。

此外，Venn分析结果表明（图4A、C），3 种大曲中独有的细菌操作分类单元（OTU）数分别为黑曲199、白曲208和黄曲340，黄曲样品的OTU数量最多，黑曲样品的OTU数量最少。真菌方面，共鉴定出53 个OTU，其中黑曲、白曲和黄曲分别含有22、40 个和35 个OTU。3 种大曲中共有116 个常见的细菌OTU和12 个常见的真菌OTU。黄曲样品中独有的细菌OTU（146）最高，高于黑曲（35）和白曲（38），而3 种曲中特有的真菌OTU较少。由此，3 种类型大曲的细菌群落可能包含更多相对丰度较高的独特细菌种类，而真菌群落可能包含各种相对丰度较低的独特真菌种类。共线性分析揭示了3 种大曲与微生物属之间的分布，可以突出样品间的相似性和差异性（图4B、D）。细菌方面，3 种大曲中包含14 个共同属。值得注意的是，黄曲中的细菌群落更具活力，含有12 个特有的菌属。相比之下，白曲仅有两个独有菌属。在真菌方面，3 种大曲共有3 个属，黑曲有1 个独特属，白曲有2 个。

4 理化指标和挥发性化合物与微生物群落的关联性分析

为探究3 种高温大曲中理化指标对核心微生物群落组成的影响，选择理化指标与丰度占比前10的细菌属及真菌属进行RDA。如图5所示，在细菌方面，发酵力、酯化力、糖化力与Bacillus呈正相关关系。酸度、水分和酒化力与黑曲中Scopulibacillus、Virgibacillus呈正相关关系。还原糖和淀粉与白曲中Thermoactinomyces呈正相关关系。在真菌中，酸度与黑曲中的Thermoascus呈正相关关系。糖化力、酯化力、发酵力与白曲中的Thermomyces呈正相关关系。

通过Spearman相关分析3 种大曲中关键挥发性化合物与核心微生物属之间潜在的关联，结果如图6所示，细菌属Bacillus、Thermoactinomyces、Weissella、Kroppenstedtia、Lactobacillus和真菌属Thermomyces、Saccharomycopsis、Wickerhamomyces与4 种酯类（乙酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、己酸乙酯）、2 种醇类（乙醇、苯乙醇）、1 种酸类（9-十六碳烯酸）、糠醛、愈创木酚呈负相关。而细菌属Virgibacillus和真菌属Aspergillus、Leiothecium、Rhizomucor、Monascus与3 种酯类（乙酸乙酯、丁酸丁酯、己酸乙酯）呈正相关关系。细菌属Bacillus和真菌属Thermomyces、Byssochlamys、Thermoascus与四甲基吡嗪、乙偶姻呈正相关。

微生物生长代谢的实质是物质合成相关代谢通路的酶催化的一系列生化反应，进而直接影响白酒发酵过程重要风味物质的生成。关联分析研究发现，3 种大曲的微生物种类繁多，群落结构与相互作用演替变化复杂多样，导致酶系组成和挥发性风味物质存在差异（图6）。

Bacillus是各类大曲中最重要、最具代表性细菌之一，具有分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和葡萄糖淀粉酶的能力，在酱香型白酒发酵过程中水解蛋白质和淀粉并产生各种风味化合物方面发挥着重要作用。蜡样芽孢杆菌可产生酒中主要风味化合物己酸乙酯。淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌可分泌α-淀粉酶，快速发酵原料中的糖分，分解为醇、酯和各种有机酸。分析结果表明，Bacillus是3 种大曲的代表性细菌，但白曲中Bacillus相对丰度却高于黑曲，究其原因，则是白曲处于曲堆顶层位置，环境含氧量较高，而黑曲位于曲垛中部，透气性差、氧量低，含氧量较高时大曲的Bacillus相对丰度会更高。另外，Scopulibacillus是黑曲具代表性的微生物之一，相对丰度高于白曲和黄曲，而Scopulibacillus与一些酯类、醇类和四甲基吡嗪呈正相关，与Yao Su等的分析结果具有一致性。Thermoascus和Thermomyces是3 种大曲的优势真菌，与四甲基吡嗪、乙偶姻呈正相关（图6）。Thermoascus和Thermomyces均属嗜热微生物，能产生淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶和脂肪酶等多种酶，且处于高温阶段优势生长的此类真菌，能增强美拉德反应和焦糖化反应，形成黑色或深褐色化合物，对高温大曲特有功能的形成具有重要作用。

5 3 种大曲细菌群落功能组成预测

PICRUSt软件广泛用于功能基因研究，根据16S rRNA基因V3～V4区扩增片段测序数据对样品中微生物功能类别的相对丰度进行基于数据库的功能预测，将菌群多样性与其代谢情况联系起来，观测不同样品组的群落功能基因在代谢途径上的差异和变化，是研究微生物群落为适应环境变化发生的代谢功能改变的有效方法之一。本研究以参与淀粉代谢及重要风味化合物形成的酶为主要对象分析3 类大曲的细菌群落组成，侧重于糖酵解、丙酮酸代谢和三羧酸循环相关途径（图7A）。分析结果表明，编码相关酶的基因丰度在黑曲、白曲和黄曲之间存在差异，而黄曲糖酵解途径中大多数酶（EC 5.3.1.9（磷酸戊糖异构酶）、EC 2.7.1.2（己糖激酶）、EC 3.1.3.11（磷酸果糖酶）、EC 4.1.2.13（果糖-1,6-二磷酸醛缩酶）、EC 5.4.2.12（磷酸葡萄糖变位酶））的相对丰度高于白曲和黑曲，说明黄曲在白酒发酵的葡萄糖转化过程中起着重要作用（图7B）。此外，丙酮酸代谢相关酶、三羧酸循环途径中的大多数酶以及丙酮酸代谢相关酶（EC 2.2.1.6（二氢乙醛-3-磷酸转乙酰酶）、EC 1.1.5.4（琥珀酸脱氢酶）、EC 1.1.1.27（乳酸脱氢酶）、EC 4.2.1.2（延胡索酸酶））在黄曲和黑曲中的丰富程度明显高于白曲（图7B）。有研究指出丙酮酸及三羧酸循环代谢活动的强度可能与大曲的颜色深浅间接相关。此外，黄曲和黑曲中醇类含量高于白曲，与官能团分析结果趋向一致，可能是由不同颜色高温大曲中酶的相对丰度差异所致。

结论

本研究通过全面分析3 种颜色高温大曲（黑、黄、白）的理化特性、微生物群落结构和挥发性风味化合物组成，揭示了它们在酱香型白酒生产中的特性和品质差异。其中，黑曲表现出较高的酸度、水分及酒化力，白曲则在糖化力、发酵力和酯化力上占优，而黄曲淀粉含量最高。微生物群落结构解析显示Bacillus、Scopulibacillus是主要优势细菌，Thermomyces、Thermoascus为主要真菌属。关键风味物质如己酸乙酯、乙酸乙酯等在各组大曲间存在显著差异，并与某些微生物如Scopulibacillus、Virgibacillus和Aspergillus呈正相关。进一步运用PICRUSt软件，结合16S rRNA基因测序数据对微生物功能类别进行预测分析，聚焦于淀粉代谢及重要风味化合物形成的酶活性相关的代谢通路，如糖酵解、丙酮酸代谢和三羧酸循环。结果显示，黄曲中涉及糖酵解途径的关键酶基因相对丰度高于黑曲和白曲，尤其在葡萄糖转化过程中可能起主导作用。此外，黄曲和黑曲在丙酮酸代谢和三羧酸循环相关酶的丰富程度上明显高于白曲，这可能间接解释了大曲颜色与其代谢活动强度以及最终生成醇类风味物质的关系。这些发现不仅阐明了不同颜色高温大曲内在品质差异的原因，还揭示了其微生物群落与风味代谢之间的潜在联系，为优化酱香型白酒生产工艺中高温大曲的选择与使用提供了科学依据和参数支持。

作者简介

通信作者：

李秀婷，教授，女，工学博士，北京工商大学食品与健康学院教授，博士生导师，北京市三八红旗奖章以及茅以升北京青年科技奖获得者。中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会常务理事、副秘书长，中国食品科学技术学会酶制剂分会理事，中国食醋产业技术创新战略联盟理事。主要从事传统发酵食品应用基础、新型酶资源及功能微生物挖掘、酶分子特性及催化机制、食品酶资源应用及功能性食品研发等方面的研究工作。近年来主持或完成国家自然科学基金重点项目1 项，面上项目5 项，国家重点研发计划课题2项及企业合作研发项目多项。以第一或通信作者在《Trends in Food Science & Technology》、《Food Hydrocolloids》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《Food Research International》等SCI期刊发表学术论文百余篇；出版学术专著2部，主编教材2部；授权国家发明专利30余件；作为第1完成人获中国商业联合会科技进步特等奖、神农中华农业科技奖二等奖、教育部高等学校科学研究优秀成果奖（科学技术）二等奖等各1 项。

第一作者：

梁二宏，男，北京工商大学食品与健康学院2021级硕士研究生，专业是食品科学与工程，研究方向为传统发酵食品酿造机理，酿造微生物资源开发与利用。在研究生期间参与“十四五”国家重点研发计划1 项。目前以第一作者在《Journal of the American Society of Brewing Chemists》国际期刊发表研究文章1 篇。

本文《3 种高温大曲功能特征与微生物群落结构差异性分析》来源于《食品科学》2024年45卷第21期166-175，作者：梁二宏，李金洋，李微微，朱 华，王 昆，张成楠，梁 鑫，陈 曦，孙宝国，李秀婷*。DOI : 10.7506/spkx1002-6630-20240208-068。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

长按或微信扫码进行注册

会议招商招展

联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）

为进一步深入探讨食品产业在当前复杂多变环境下的高质量发展路径，并着重关注食品科学、营养安全保障的基础研究与关键技术研发，贯彻落实“大食物观”和“健康中国2030”国家战略，北京食品科学研究院和中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志，将与国际谷物科技协会（ICC）、湖南省食品科学技术学会、湖南省农业科学院农产品加工研究所、湖南农业大学、中南林业科技大学、长沙理工大学、湘潭大学、湖南中医药大学、湖南农业大学长沙现代食品创新研究院共同举办“第十二届食品科学国际年会”。本届年会将于2025年8月9-10日在中国 湖南 长沙召开。

长按或微信扫码进行注册

会议招商招展

联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）