斑马鱼行为篇（120）：斑马鱼三选一序列反应时任务

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斑马鱼是一种成熟且广泛应用的发育遗传学模型系统，可利用三选一序列反应时任务（3-CSRTT）来研究斑马鱼在刺激控制方面的多个维度。

实验装置

所有的行为测试都在一个定制的水箱中进行。该水箱由一个半透明、不反光的丙烯酸材质箱体构成（高×宽×长：12厘米×12厘米×20厘米），安装有不透明的隔板，以形成反应孔和食物投放区，并装有3升水族箱水（注意，水温保持与饲养水箱中的水温相同，以尽量减少转移过程中斑马鱼的应激反应）。刺激物由三个低电压黄色发光二极管（3.4伏）和一个低电压绿色发光二极管（3.4伏）组成，所有这些发光二极管都使用水族箱密封胶安装在箱体内的防水塑料管中。黄色发光二极管位于分隔的反应孔后方，绿色发光二极管位于食物投放区后方。实验人员可通过一个开关盒独立控制每个发光二极管。测试水箱放置在一个大型的隔音和遮光的木质（中密度纤维板）箱内。光线由安装在箱体顶部的一个40瓦灯泡提供。一个摄像头（微软网络摄像机）也安装在箱体顶部，以便对测试水箱中的斑马鱼进行持续的实时观察。刺激灯光、室内灯光、食物投放和隔板均由实验人员在箱体外部操作，以避免测试过程中人类的存在给斑马鱼造成任何应激反应。斑马鱼会得到少量悬浮在水箱水中的活丰年虾作为强化物，通过一个连接在手动微量注射器上的玻璃注射器来投放的。注射器配有一根柔性塑料管（导管管；直径 = 1毫米），该管延伸到水箱内。一次注射3微升的悬浮液可投放约5至10只活丰年虾，其数量的任何变化都归因于丰年虾在喂食管中的分布情况。每次试验时都小心确保每只斑马鱼在注射器中的丰年虾密度相同，从而尽量减少动物之间因强化物水平不同而可能产生的混杂影响，每只斑马鱼都单独进行测试。

灯光由1个绿色发光二极管和3个黄色发光二极管（3.4伏）组成，实验人员可通过位于外部的开关盒对其进行控制。水箱由不透明塑料制成，内部隔板和屏障也是如此。这些发光二极管被插入塑料插件中，并固定在水箱内部。测试水箱放置在一个内部装有照明且衬有聚苯乙烯的木质（中密度纤维板）箱内。

实验步骤：

习惯化和定向

所有的斑马鱼都在测试房间内适应48小时。所有的训练和测试都在周一至周五（08:30至18:00）进行。

在训练的第一天，斑马鱼在测试水箱中适应12分钟。在大量的预实验测试中，最初让斑马鱼训练20分钟。然而，发现在训练10到12分钟后，斑马鱼的表现确实会下降（也就是说，斑马鱼出现大量不做出反应的情况，并且无法对刺激做出回应）。因此，所有的预训练和训练环节都持续12分钟。在适应阶段以及随后所有的行为训练和测试中，每次测试斑马鱼的顺序在各环节之间都是随机安排的。此外，在每个环节中，斑马鱼都是用网从饲养水箱转移到测试水箱的。在每个环节开始之前，会给斑马鱼2分钟的时间来适应水箱。在适应阶段，刺激发光二极管和食物投放区的发光二极管都会亮起，并且屏障始终保持打开状态。适应阶段结束后，开始进行食物投放区训练。每次试验开始时都有10秒的试验间隔时间（ITI），之后食物投放区的灯光亮起（Sd；绿色发光二极管），持续30秒，或者直到斑马鱼进入投放区的孔洞。当绿色发光二极管（Sd）亮起时，斑马鱼进入食物投放区的行为会得到一次食物奖励。在给予奖励后，绿色发光二极管（Sd）会熄灭。如果斑马鱼在30秒内没有进入食物投放区，绿色发光二极管（Sd）就会关闭，本次试验在没有奖励的情况下结束，然后开始试验间隔时间。这个过程每个环节持续12分钟，并连续重复三天（第2天至第4天）。

在食物投放区训练之后，开始训练斑马鱼接近水箱的反应孔洞（第5天至第7天）。所有环节都以绿色发光二极管亮起开始，并且一旦斑马鱼进入食物投放区，第一次试验就开始。就在第一次试验之前，屏障会升起，反应孔洞的灯光会同时亮起。这些灯光会一直亮着，直到斑马鱼进入其中一个孔洞，或者持续1分钟，以先发生的情况为准。正确进入孔洞的行为会通过亮起绿色发光二极管作为条件性奖励，进入食物投放区的奖励方式和之前一样。一旦斑马鱼穿过屏障回到食物投放区，屏障就会降下。所有后续的试验都在10秒的试验间隔时间之后开始，在此期间所有的刺激灯光都会熄灭。室内灯光在整个环节中始终亮着。所有环节持续12分钟，或者直到斑马鱼获得20次奖励为止，记录每2分钟内获得奖励的试验次数。

在预训练的最后阶段（第8天至第9天，屏障会升起，并且其中一个反应孔洞的灯光会亮起。该刺激灯光会一直亮着，直到斑马鱼进入正确的孔洞，之后灯光会熄灭，食物投放区的灯光会亮起，直到斑马鱼进入。在训练的所有初始阶段会记录每个环节中获得的奖励次数。

三选一序列反应时任务：

在单灯训练的最后一天之后，开始进行三选一序列反应时任务（3-CSRTT）训练。在这个任务版本中，使用了三个刺激孔洞，这样做的原因是这个任务是全新的，而且之前关于斑马鱼涉及复杂空间辨别能力的工具性学习的研究非常有限。在预实验中，注意到当试验间隔时间、刺激持续时间和限时保持期都为5秒时，斑马鱼能够迅速达到可接受的表现准确率水平，因此，在任务训练一开始就采用了这些时间设置。此外使用了一个屏障，在试验间隔时间之前以及在做出正确或错误反应之后，这个屏障都会升起和降下。这样做的原因是，希望确保斑马鱼在试验开始时能够看到所有的刺激孔洞（也就是说，屏障能确保它们处于测试水箱的正确区域），同时也用来标志试验的结束（在啮齿动物实验中，这是通过室内灯光来实现的，但在预实验中发现，对斑马鱼来说，开关灯光会让它们产生应激反应）。

3-CSRTT训练持续9天（每次训练时长12分钟）。每次训练开始时，斑马鱼要在实验装置中适应5分钟，之后升起屏障，点亮其中一个刺激灯光。一旦斑马鱼游进亮灯的孔洞，训练环节就开始。如果斑马鱼在5分钟内没有进入孔洞，该次训练就会停止，斑马鱼会被放回饲养水箱。如果这种情况连续出现超过两次，那么这条斑马鱼将被排除在后续研究之外。在这之后，升起屏障，开始试验间隔时间（训练时为5秒，长试验间隔时间测试时为10秒）。在此期间，斑马鱼的任何反应都会导致屏障降下（即一旦斑马鱼游回水箱的食物投放区），并且斑马鱼会受到10秒的暂停惩罚。如果斑马鱼没有过早进入，三个刺激灯光中的一个会亮起（伪随机顺序），持续5秒，随后是5秒的限时保持期（即灯光熄灭，屏障保持打开）。在此期间的任何正确反应都会以点亮食物投放区灯光作为条件性奖励。斑马鱼游回食物投放区时会得到一次奖励，并且当它游回食物投放区时屏障会降下。在投放食物后，在进行下一次试验之前必须暂停20秒，这是为了让斑马鱼有时间吃掉奖励物。预实验表明，奖励后的暂停时间过短会导致高未反应率（即斑马鱼没有在设定的时间限制内完成试验）。最后，如果斑马鱼做出错误反应（即进入了未亮灯的孔洞），或者在刺激呈现期间或限时保持期内没有进入任何孔洞，该次试验将在没有奖励的情况下结束，并且当斑马鱼游回食物投放区后屏障会降下，它会受到10秒的暂停惩罚。

在第18天，通过采用长试验间隔时间测试来检测所有斑马鱼的基础过早反应率。在这次测试中，试验间隔时间延长至10秒，而刺激呈现时间和限时保持期仍保持为5秒。在第19天，进行一次时长为5秒试验间隔时间的单次提醒训练。在第20天，进行第一次药物处理。食物投放和灯光操作由同一位观察者进行。在测试期间，观察者不知道斑马鱼接受的是何种处理。在第21天，斑马鱼接受第二次提醒训练（即不使用药物，试验间隔时间为5秒），最后在第22天，进行第二次药物处理。

在3-CSRTT训练和测试过程中，采用多种行为测量指标。这些指标包括：

准确率：计算方法为 正确反应次数/（正确反应次数+错误反应次数）。

未反应率：计算方法为 未反应次数/（正确反应次数+未反应次数+错误反应次数）。

过早反应率：计算方法为 过早反应次数/（正确反应次数+未反应次数+错误反应次数+过早反应次数）。

参考文献：

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