扬州大学食品科学与工程学院Liu Yang等重点阐明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在乳制品行业中的出现情况、其与生物膜形成和乳制品腐败相关的生化特征以及潜在的控制策略。
Introduction
近年来,在乳制品中已检测和筛选出芽孢杆菌,因此乳制品中的芽孢杆菌受到了越来越多的关注,并且对这些微生物的要求也变得越来越严格。由于乳制品加工时间长且产量高,难以满足对芽孢形成菌的严格要求,控制乳制品中的芽孢数量对乳制品行业来说是一个挑战。
芽孢杆菌属是乳制品中主要的产芽孢细菌之一,包括蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和厌氧芽孢杆菌等几种菌种。研究表明,芽孢杆菌属的细菌在生牛乳中占主导地位,其主要来源是乳牛场环境。在乳制品加工过程中,它们能够逃过巴氏杀菌和超高温灭菌,并利用牛乳中的营养物质存活和萌发。
蜡样芽孢杆菌是一种产芽孢细菌,部分厌氧,革兰氏阳性杆菌,可轻易从乳牛场环境以及诸如生牛乳和多种乳制品等食品中分离出来。蜡样芽孢杆菌的芽孢主要通过土壤和空气传播。食用被蜡样芽孢杆菌污染的食物会导致腹泻。
研究发现,蜡样芽孢杆菌能分泌肠毒素和呕吐毒素,食用被蜡样芽孢杆菌污染且含量超过5 (lg(CFU/g))的食物会引发肠胃问题、呕吐、腹泻甚至死亡。蜡样芽孢杆菌多次引发食源性疾病暴发。因此,乳制品行业中蜡样芽孢杆菌带来的健康风险需要迅速且妥善地处理。
在当代社会,全面了解蜡样芽孢杆菌在乳制品行业中的传播、安全和质量特征以及潜在危害的控制措施,可能会减少蜡样芽孢杆菌对健康的危害。
Results
1 乳品行业蜡样芽孢杆菌的患病率和检测
1.1 生牛乳中蜡样芽孢杆菌的流行率
蜡样芽孢杆菌在环境中广泛存在,其对乳制品的污染可通过多种基质传播。此外,这种微生物具有强生命力,能形成芽孢,这些芽孢可耐受多种恶劣环境,并在有营养物质的低温环境下增殖。同时,蜡样芽孢杆菌可通过多种途径进入生牛乳。
1.2 蜡样芽孢杆菌在乳制品加工环境中的流行情况
微生物群落会从浮游状态转变为聚集状态形成生物膜,生物膜由生物膜细胞和包裹生物膜细胞的细胞外基质组成。生牛乳中的芽孢杆菌属细菌能够在中温和高温条件下存活和生长,并且在牛乳加工过程中能经受住巴氏杀菌、超高温灭菌等程序。它会附着在加工设备表面。生物膜比浮游细胞更能抵抗抗菌剂和清洗程序。这使得在乳制品行业中很难消除蜡样芽孢杆菌。蜡样芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种,具有很强的生物膜形成能力,并且经常从乳制品加工设备表面分离出来。
1.3 蜡样芽孢杆菌在最终乳制品中的流行情况
蜡样芽孢杆菌存在于不同的乳制品中,如乳粉、超高温灭菌牛乳、巴氏杀菌牛乳和奶酪。所以开发预测模型对于评估蜡样芽孢杆菌在不同乳制品贮藏、运输和分销过程中的行为很重要。蜡样芽孢杆菌已被强调为食物中毒的关键食源性病原体之一。在商业乳制品中,携带溶血素和肠毒素基因的蜡样芽孢杆菌发生率很高。除此之外,乳业中抗生素的滥用,许多蜡样芽孢杆菌对抗生素具有耐药性。通过水平基因转移,抗生素耐药基因可能会转移到人类消化道,食用含有耐药基因蜡样芽孢杆菌的乳制品会给人们的健康带来巨大负担。
1.4 最终乳制品中蜡样芽孢杆菌的检测
虽然起初可以通过传统的表型和基因型鉴定方法识别蜡样芽孢杆菌,但目前缺乏快速、高效且更精准的检测和鉴定蜡样芽孢杆菌的方法。费尔南德斯等开发了一种基于多重聚合酶链式反应的高灵敏度方法,以两种基因为靶点,可同时快速且准确地对蜡样芽孢杆菌进行鉴定和检测。以motB基因为靶向,设计了引物BCFomp1/BCRmop1,用于蜡样芽孢杆菌的特异性检测。磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C是蜡样芽孢杆菌的一种分泌物,参与细胞的溶血活动,该酶由pc-plc基因编码。马丁内斯-布兰奇等研究了一种以pc-plc基因作为靶点的实时定量PCR方法评估芽孢浓度。然而,由于成品乳制品中蜡样芽孢杆菌的芽孢浓度过低,难以直接进行PCR检测,所以在常规检测前需要进行繁琐的芽孢富集测定。此外,牛乳中大量离子和脂肪的存在会抑制实时定量PCR的正常运行。菲舍尔等开发了一种基于适配体的牛乳分析捕获方案,该技术成功克服了复杂食品基质对实时定量PCR检测的干扰作用,并提高了PCR检测的检测限。
2 样芽孢杆菌生物膜的形成及其潜在机制
2.1 蜡样芽孢杆菌菌株形成生物膜的能力
蜡样芽孢杆菌在乳制品生产线中广泛存在,是因为其较强的生物膜形成能力。在食品工业中,生物膜占据着重要的生态位,并且能够形成芽孢(耐热耐酶),在食品加工中导致食品变质。蜡样芽孢杆菌生物膜主要存在于气液交界处,然而,该细菌的一些菌株能够在浸没表面形成生物膜。这些生物膜能沿着管道长距离迁移,并被输送到加工的各个阶段,甚至进入产品,这给消费者带来了健康风险。在食品加工生产线中,其生物膜常与其他微生物结合,在表面会产生一种预处理效应,促进其他细菌的快速附着,若没有蜡样芽孢杆菌形成的生物膜,这些细菌会被水流、牛乳流或其他物理机制清除。在乳制品行业中,蜡样芽孢杆菌通常在流动的条件下形成生物膜,然而,大多数研究在静态下测试生物膜的形成。这表明当前的实验研究应开发一种模拟实际乳制品生产的模型。
2.2 影响蜡样芽孢杆菌生物膜形成的因素
蜡样芽孢杆菌生物膜的形成通常受多种因素影响,比如温度、酸碱度以及碳源等。在自然界中,微生物通常以混合形式存在,竞争、共生以及协作相互作用通常会影响生物膜的形成能力和生物膜的特性。
2.3 用于生物膜研究的组学技术
由于乳制品行业中蜡样芽孢杆菌生物膜的复杂性,有必要基于当前研究运用组织学技术,包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等高新技术。
在先前的研究中,对蜡样芽孢杆菌生物膜形成开展了全基因组研究中采用了2 种全基因组方法,即转座子插入突变和通过RNA测序进行的全局转录组分析。结果显示,在生物膜生成阶段,碳代谢以及各种小分子化合物的发酵合成在生物膜合成中发挥着积极作用。另一项研究通过转录组分析也显示了核苷酸生物合成在蜡样芽孢杆菌生物膜形成中的重要作用。通过转录组分析了不同来源的蜡样芽孢杆菌生物膜细胞中基因转录水平的变化。这表明不同的碳源会影响蜡样芽孢杆菌的碳循环,进而影响生物膜中胞外多糖的合成。在尽管每一种组织学分析都能提供有用的知识,但是单一的组学分析仅描述核酸、蛋白质或代谢水平上的单一数据,并不能对生物膜形成的详细且精确的机制以及混合中的复杂相互作用进行特征描述。
3 蜡样芽孢杆菌导致腐败的可能性
乳制品是世界上损耗最严重的食品之一。芽孢杆菌的存在及生长是乳制品腐败和浪费的一个主要原因。蜡样芽孢杆菌具有很强的产生蛋白水解酶、脂肪酶和卵磷脂酶的能力。蜡样芽孢杆菌产生的蛋白酶会导致超高温灭菌牛乳出现老化凝胶现象以及蛋白质沉淀,这极大地缩短了其保质期。乳制品中的蜡样芽孢杆菌具有很强的产蛋白酶能力,而且随着蜡样芽孢杆菌数量的增加,乳制品中蛋白酶的活性也会增强。在一定范围内,蛋白酶活性会随温度升高而增强。这就要求必须严格控制乳制品运输和贮藏的温度,以及生乳中蜡样芽孢杆菌的含量。有研究表明,一些蜡样芽孢杆菌能分泌耐热碱性蛋白酶,这种酶在碱性pH值以及高达70 ℃的温度下仍能保持稳定。这种酶很可能经受得住乳制品加工过程中的热处理和原位清洗,并且能够分解乳制品中的蛋白质、脂质和乳糖类物质。
4 控制潜在蜡样芽孢杆菌的策略
减少由蜡样芽孢杆菌导致的乳制品腐败应侧重于热处理工艺,以及通过保持加工环境的清洁和卫生来防止二次污染。然而,蜡样芽孢杆菌的芽孢有很强的耐热性,而且研究表明,在生物膜中形成的芽孢热稳定性更强。蜡样芽孢杆菌芽孢无处不在,加工过程中易形成生物膜,这使得其容易出现在成品乳制品中。
4.1 生物防治方法
使用天然抗菌剂是防止乳制品变质的一种理想的方式。壳聚糖是一种天然存在的无毒多糖,它通常来源于甲壳素。昆虫来源的壳聚糖对蜡样芽孢杆菌的杀菌能力取决于温度以及培养物浓度,在10 ℃时,质量浓度为180、150 mg/mL的壳聚糖具有杀菌能力,但在20、30 ℃时,相同壳聚糖仅具有抑菌作用,而无杀菌效果。较高分子质量的壳聚糖通过阻止营养物质的摄取致使蜡样芽孢杆菌的营养体死亡,但不会影响其芽孢。此外,较低分子质量的壳聚糖可通过渗入细胞对蜡样芽孢杆菌的营养体造成更明显的损伤。
溶菌酶是一种具有抗菌活性的天然酶,是人体免疫系统的固有成分,毒性较低;它可被视为食品和制药行业中使用的一种天然抗菌剂,已被美国食品药品监督管理局认定为一般公认安全物质,可作为一类酶用于生产,并且被联合国粮食及农业组织认定为食品,已被证明是一种防止奶酪变质的天然制剂;此外,欧洲添加剂指令也批准使用溶菌酶作为控制奶酪变质的防腐剂。溶菌酶可作为控制蜡样芽孢杆菌的一个候选物,但在乳制品保鲜中其确切的添加浓度尚不明确。除了直接将溶菌酶添加到乳制品中用于保鲜外,溶菌酶还可作为包装中的抗菌剂使用,减少成品乳制品的微生物污染。
4.2 物理方法
牛乳离心除菌是一种用于在牛乳生产线巴氏杀菌过程中去除耐热微生物的技术方法。蜡样芽孢杆菌是乳制品环境中最重要的致腐微生物之一,其芽孢具有很强的耐热性,能够在乳制品行业常规的巴氏杀菌过程中存活下来。牛乳离心除菌可使牛乳中的芽孢水平降低。
在另一项研究中,单独进行巴氏杀菌或者将巴氏杀菌与超声处理相结合的方式,能够灭活耐热的芽孢杆菌属细菌,并完全消除脱脂牛乳中含量超过6 (lg(CFU/mL))的芽孢杆菌细胞,而超声处理可从物理层面分解形成芽孢杆菌的细菌。超声、加热和加压相结合的方式对去除蜡样芽孢杆菌芽孢具有更显著的效果,经这3 种方法联合处理后存活下来的芽孢其细胞结构受到了严重破坏,这些结果意味着超声与加热、加压相结合对蜡样芽孢杆菌芽孢具有显著的杀菌效果,这或许是一种很有前景的绿色灭菌技术。
微波体加热能确保特定的热负荷,缩短能量暴露时间,提高乳制品的质量,是工业应用中可替代巴氏杀菌的一种方法。研究结果显示,该技术显著减少了蜡样芽孢杆菌的数量,但不能将蜡样芽孢杆菌的数量降低至检测限以下,这就需要去探索更合适的微波体加热功率。
另一种或许能减少蜡样芽孢杆菌污染的物理方法是高压处理。高压处理是一种能够在不影响乳制品质量的情况下减少微生物数量的方法。
4.3 栅栏技术
栅栏技术是指将2 种或更多种杀菌技术相结合,这些技术以不同方式作用于细菌,从而实现有效去除乳制品加工环境中的微生物。此前的一项研究表明,细胞壁水解酶与肉桂醛的组合对抑制蜡样芽孢杆菌具有协同作用。
4.4 其他方法
生物膜附着在加工设备表面会对乳制品的安全和质量产生不利影响。尽管人们在应对乳制品生物膜问题方面付出了努力,但在乳制品行业中,仍缺乏方法彻底解决与生物膜相关的问题。经研究发现,使用镀镍聚四氟乙烯涂层的钢材能够有效减少蜡样芽孢杆菌生物膜的附着,减少量超过2 (lg(CFU/ cm²)),而且普通不锈钢在用水和碱性洗涤剂进行原位清洗后,其生物膜的生物量残留分别为3、1 (lg(CFU/cm²)),但镀镍聚四氟乙烯涂层钢材在经过原位清洗后,其生物膜生物量降低至检测限以下。上述研究结果表明,表面改性清洁操作效率更高,省时、省力且节约成本。它可作为乳制品行业中一种替代性的抗生物膜技术,用于应对细菌污染并提高最终乳制品的微生物质量。
芽孢杆菌具有高度的生物多样性且分布广泛。通常出现在卫生条件不佳的小型乳牛场中,这会导致最终乳制品的质量下降。从实际来看,有必要提高乳农的卫生意识,并在乳牛场落实良好的生产规范,以减少芽孢杆菌的数量,使微生物含量达到检测标准。
此外,实施预测微生物生长模型对于乳制品行业控制微生物生长、提高乳制品质量以及延长乳制品保质期都非常重要。这些新兴技术在乳制品行业未得到广泛应用,所以在实际应用时,应当谨慎行事,确保这些方法不会以消费者无法接受的方式改变乳制品的感官特性和营养特性。这一点此前一直被忽视,但在未来的研究中应当予以考虑。还应当关注这些方法是否符合绿色理念,以确保乳制品行业未来的可持续发展。
Conclusion
乳制品生产过程中蜡样芽孢杆菌的存在已被视为乳制品行业所关注的问题之一。它能形成芽孢,常见于生乳、生鲜乳制品、成品乳制品以及乳制品加工环境中。这种细菌的主要来源可能是养殖场环境,其在乳制品加工过程中的繁殖会增加乳制品受细菌污染的风险。然而,目前缺乏足够的知识来证实上述假设。蜡样芽孢杆菌在乳制品污染中所起的作用已日益受到重视。为了适应乳制品加工中的杀菌步骤,蜡样芽孢杆菌进化出了许多特定的生存策略,它也是导致乳制品腐败以及食源性疾病的原因。然而,目前的研究大多仍处于实验室阶段,并没有模拟工业生产中真实的乳制品加工条件,例如,没有考虑到工业生产中牛乳的流动性。此外,虽然蜡样芽孢杆菌的益处已得到证实,但越来越有必要针对具体情况对蜡样芽孢杆菌菌株的安全性进行评估。
Abstract
Bacillus cereus is one of the major spore-forming bacteria with great genetic diversity in raw milk, dairy raw materials, and finished dairy products, and is widely present in the entire dairy production line. Due to the biofilm formation of B. cereus and the heat resistance of its spores, traditional cleaning and disinfection procedures cannot completely remove the spores, resulting in the presence of B. cereus in the final dairy products. Although much work has been done to identify B. cereus from various dairy samples, an updated knowledge of this spore precursor is still needed. This review describes the prevalence of B. cereus from raw milk to commercial dairy products, the biofilm formation of B. cereus and its ability to cause spoilage in dairy products, and the possible prevention methods.
引文格式
Liu Y, Zhang B, Wang S, et al. Different risk potential of Bacillus cereus to the dairy industry − keeping up with the old story. Food Science of Animal Products, 2024, 2(4): 9240085. https://doi.org/10.26599/FSAP.2024.9240085
作者介绍
袁磊 副教授
扬州大学食品科学与工程学院
袁磊,博士/博士后,扬州大学食品科学与工程学院副教授,入选江苏省双创博士、扬州市绿扬金凤计划,主要研究方向为乳品微生物安全,担任《International Journal of Dairy Technology》《Quality Assurance and Safety of Crops & Foods》《Journal of Dairy Research》编委,主持国家自然科学基金、江苏省自然科学基金、中国博士后基金特别资助等省部级项目4 项,发表SCI论文80余篇,授权发明专利5 项。
编辑:王书华、阎一鸣; 责任编辑:刘莉
为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战,促进产学研用各界的交流合作,由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心(动物替代蛋白)及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办,西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。
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