在精准医学时代,肿瘤研究正从传统单一实验走向“干湿结合+人工智能“的智能科研时代。通过生物信息学(干实验)筛选关键基因,再通过分子生物学实验(湿实验)验证功能,既能提高研究效率,又能确保结果的可靠性。今天,我们就以胃癌为例,拆解如何用“干湿结合”策略从海量数据中锁定关键基因,并设计后续实验验证其机制。
一、数据获取与预处理:从TCGA数据库出发
1. 数据下载:从TCGA数据库获取胃癌的RNA-seq转录组数据和临床数据,包括基因表达矩阵、患者分期、生存时间等。
2. 数据清洗:去除低质量样本,去批次效应,标准化处理(TPM/FPKM),填补缺失值,剔除异常值, 使用 R 语言的DESeq2进行标准化,确保数据可比性。
二、样本分组:临床与分子特征双管齐下
1. 基于临床特征分组:按TNM分期(I–IV期);按组织学类型(腺癌、鳞癌等);按生存状态(生存组 vs. 死亡组),相关分析
2. 基于分子特征分组:基因表达聚类(K-means、层次聚类);按TCGA分子分型(如EBV+、MSI、CIN等),聚类分析
三、差异表达分析:锁定关键基因
1. 识别差异表达基因(DEGs):使用DESeq2或edgeR进行差异分析;筛选标准:p < 0.05,|log2FC| > 1
2. 可视化呈现:火山图:展示显著上/下调基因;热图:聚类分析关键基因表达模式
四、功能富集分析:探索基因背后的生物学意义
1. GO/KEGG分析:使用clusterProfiler进行功能注释,关注肿瘤相关通路(如Wnt、PI3K-AKT、p53等)
2. GSEA分析:识别表型相关的基因集(如EMT、免疫逃逸)
五、生存分析:基因的临床价值:
1. Kaplan-Meier分析:筛选与患者生存显著相关的基因(log-rank p < 0.05)
2. Cox回归分析:多因素Cox模型识别独立预后因素
六、构建预后模型:从基因到临床预测
1. LASSO回归筛选关键基因:避免过拟合,提高模型稳健性
2. 构建风险评分模型:计算患者风险评分(Risk Score),划分高/低风险组
3. 模型验证:训练集 vs. 验证集,ROC曲线评估预测效能
七、免疫浸润分析:探索肿瘤微环境
1. 免疫细胞组成分析:使用CIBERSORT、TIMER估计免疫细胞浸润
2. 免疫检查点研究:分析PD-1、CTLA-4等免疫治疗靶点的表达
八、药敏分析:寻找潜在治疗药物
1. 药物敏感性预测:基于GDSC/CTRP数据库预测敏感药物
2. 药物-基因网络构建:识别潜在药物靶点(如激酶抑制剂)
九、多组学整合:全面解析胃癌机制
基因组:突变、CNV分析
转录组:关键基因调控网络
表观组:甲基化、组蛋白修饰
蛋白组:免疫组化或WB或流式,验证蛋白表达
十、网络分析:挖掘核心调控基因
1. WGCNA共表达网络:识别关键模块和Hub基因
2. PPI网络分析:使用STRING数据库构建互作网络
十一、湿实验验证:从生信预测到实验证实
1. 体外实验(In Vitro)
基因操作:过表达/敲除(CRISPR-Cas9、siRNA)
表型检测:增殖(CCK-8)、迁移(Transwell)、凋亡(流式)
机制研究:Western Blot检测通路蛋白(如AKT、ERK)
2. 体内实验(In Vivo)
小鼠模型:异种移植瘤实验
免疫组化(IHC):验证基因在组织中的表达
3. 分子机制研究,深入研究关键基因在胃癌中的分子机制,揭示其调控网络。
转录调控:通过ChIP-seq或ChIP-qPCR分析关键基因的转录因子结合位点。研究关键基因是否受表观遗传调控(如DNA甲基化、组蛋白修饰)。
表观调控:研究关键基因是否受miRNA、lncRNA或circRNA调控。通过双荧光素酶报告基因实验验证非编码RNA与关键基因的相互作用。
代谢调控:研究关键基因是否影响胃癌代谢重编程(如糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢)。
免疫调控:研究关键基因是否影响肿瘤微环境中免疫细胞浸润(如巨噬细胞、NK细胞)。
“干湿结合”不仅推进肿瘤关键基因的发现,也推动转化医学发展。随着单细胞测序、空间转录组等技术普及,智能科研将更加精准高效,为肿瘤治疗提供新靶点!
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