FC | 福州大学汪少芸教授郑瑜雪博士团队在一区Top杂志发表成果：挤压玉米淀粉-咖啡酸复合物的益生元特性

近日，福州大学汪少芸教授团队在Food Chemistry杂志上发标最新成果，标题为“Prebiotic properties of extruded maize starch-caffeic acid complexes: A study from the small intestine to colon in vitro”。福州大学郑瑜雪博士为第一作者，浙江大学田金虎教授和福州大学汪少芸教授为通信作者。

摘要

最近的研究表明，淀粉-多酚复合物对肠道健康有积极影响，但玉米淀粉-咖啡酸复合物的益生菌效果仍未得到充分研究。因此，本研究旨在从小肠到结肠研究玉米淀粉-咖啡酸复合物的益生作用。首先，玉米淀粉与咖啡酸挤压，进行体外消化，未消化的部分进行体外发酵，并研究其结构特征、短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）和微生物群落。结果表明，咖啡酸降低了挤压后玉米淀粉的长/短程有序性，显著增加了抗性淀粉至（30.35±2.36）%。体外发酵表明，微生物首先利用残留物中的非晶区，促进SCFAs的产生和双歧杆菌和乳杆菌属的生长。总体而言，挤压玉米淀粉-咖啡酸复合物的益生素特性表明，它们可以作为具有健康益处的功能性食品。

Induction

淀粉是人类非常重要的资源，可水解为葡萄糖并易于吸收，因此可为日常生活提供约40%～60%的能量。然而，淀粉在人体内快速水解为葡萄糖可能会诱发许多风险，如高血糖、II型糖尿病等。到目前为止，已有许多物理、化学和生物方法被用来修饰淀粉以获得较慢的消化速度。特别是，人们越来越关注使用植物化学品制备淀粉-植物化学复合物，以控制消化过程并实现完美的主食。研究表明，植物化学品可以增强酶活性和淀粉的理化性质，并增加缓消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）和抗性淀粉（resistant starch，RS）的含量，从而延缓淀粉体外水解速率。

由于淀粉-多酚复合物中抗性淀粉含量高，抗性淀在小肠消化后的益生特性值得关注。抗性淀粉可以作为有益肠道细菌的底物，促进它们的生长和活性。此外，植物化学物质，如类黄酮花青素和酚酸，已被广泛研究为“益生元”，并改变肠道微生物群的生态（双歧杆菌、乳酸杆菌和肠球菌等），并促进短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）的生产，从而促进宿主健康。因此，淀粉-多酚复合物不仅能提供营养益处，还能积极促进肠道菌群组成和功能。越来越多的研究表明，淀粉-多酚复合物也被认为是一种新型的抗性淀粉。例如，阿魏酸、咖啡酸、胆酸、异槲皮素、黄芪素和金丝桃素与红薯淀粉复合，刺激鼠李酸乳杆菌和双歧杆菌的生长，同时抑制大肠杆菌的增长。此外，鞣酸可以帮助淀粉促进SCFAs的生产和益生菌的丰富。这些结果表明，多酚和淀粉的加入对肠道健康有积极作用。

鉴于RS和植物化学物质在小肠中的有益影响，研究复合物在从小肠向大肠过渡时如何影响肠道健康是至关重要的。在我们之前的研究中，挤出技术是一种绿色环保的技术，可以增强绿原酸与水稻淀粉的结合，并增加绿原酸的比例。咖啡酸的结构允许与淀粉有效的非共价相互作用，如氢键和π-π堆积，改变淀粉的物理化学性质，如溶解性和稳定性。此外，咖啡酸广泛可得，性价比高，并为产品添加了营养和治疗益处。基于此，我们假设挤压的玉米淀粉-咖啡酸复合物可以增加RS水平，然后它们可能会被肠道微生物降解和利用，从而产生有益物质，如SCFAs。为进一步验证这一假设，制备了玉米淀粉咖啡酸复合物，并进行了体外消化。此外，将含咖啡酸的挤出玉米淀粉残留物（residues of extruded maize starch with caffeic acid，REMS-CA）和不含咖啡酸的挤出玉米淀粉残留物（residues of extruded maize starch without caffeic acid，REMS）的消化残渣暴露于粪便微生物群。通过SEM、X射线衍射、FTIR、UPLS-TOF-MS2和16S rRNA基因测序技术，测定了在体外发酵期间获得的相应发酵残渣的结构特征、SCFAs水平、咖啡酸代谢物和微生物群组成。我们的研究可能为使用挤压玉米淀粉-咖啡酸作为功能性食品物质来改善血糖稳态和调节肠道健康提供理论基础，这可能对身体健康有益。

Results

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发酵过程中络合物的消化残留物特性

玉米淀淀粉颗粒在挤出过程中破碎并糊化，如图1A所示。咖啡酸的加入降低了凝胶化程度，这可能归因于水的相互作用，并使淀粉难以凝胶化。此外，咖啡酸的结合量增加到12.36 mg/g，这意味着约61.8%的咖啡酸与玉米淀粉结合，这低于阿魏酸。图1B显示了样品的XRD图谱，正常玉米淀粉在15.0°、17.1°、18.1°和22.5°（2θ）处显示出典型的衍射峰，由A型淀粉的典型峰组成（图1B）。EMS和EMS-CA复合物的晶体类型也表现出2θ在13.0°、15.2°、17.1°、19.8°和22.9°（2θ），在15.0°和22.5°（2θ）的衍射峰强度降低，在18.1°（2θ）的峰几乎消失，在与咖啡酸挤出后保持A＋V型。此外，随着咖啡酸的加入，在12.9°和19.8°（2θ）有更多的明显衍射峰，表明咖啡酸可以进入双螺旋形成V型结构。此外，还观察到，随着咖啡酸比例的增加，相对结晶度下降，这表明咖啡酸在挤出过程中会破坏玉米淀粉的长程有序。采用FTIR分析法评估不同咖啡酸配比对玉米淀粉的影响，如图所示1C。特征吸收峰在3450 cm－1处的强度随着咖啡酸的增加而增强。结果表明，在1047、1022 cm－1处的吸收带分别代表淀粉的有序结构和非晶态结构。1047/1022 cm－1和1022/995 cm－1的比值是有序度和双螺旋度变化的指标。正常玉米淀粉的R1047/1022和R1022/995值分别为1.82和0.896。如表1所示，咖啡酸挤出后，R1047/1022的值增加，表明咖啡酸增加了玉米淀粉的短程顺序，相反，R1022/995的值减少，表明在加入咖啡酸后，玉米淀的双螺旋结构被破坏。

图1 淀粉样品的SEM（A）、淀粉样品的XRD图谱（B）和FTIR图谱（C）

玉米淀粉中RDS、SDS和RS的含量分别为（72.89±1.39）%、（17.24±2.63）%和（9.87±1.25）%。而EMS中RDS含量显著下降，RS含量显著增加（表1）。这种现象也发生在稻米淀粉中，挤压降低了稻米淀淀粉中的RDS、SDS含量，并提高了水稻淀粉中的RS含量，这主要是由于挤压过程形成了更多的小分子质量物质，包括松果苷和麦芽糖。咖啡酸添加量为1.5%和2.0%（m/m）时，RS含量分别增加到（28.78±1.31）%和（30.35±2.36）%，表明挤出玉米淀粉-咖啡酸复合物具有控制葡萄糖释放和调节血糖水平的能力。SDS和RS的含量没有显著下降，这表明加入1.5%和2.0%（m/m）咖啡酸以减少淀粉水解是一个极限。考虑到RS和结合咖啡酸含量高，选择EMS-2.0CA在体外消化后发酵，并标记为REMS-CA。天然玉米淀粉的残留量被标记为RMS。

表1挤压玉米淀粉-咖啡酸复合物的理化性质

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发酵过程中络合物的消化残留物特性

2.1 发酵过程中络合物残留物的形态

由于高温和压力，挤压过程促进了玉米淀粉的糊化。此外，复合物的外观不规则，表面没有明显的淀粉颗粒（图1）。在0 h，REMS显示出大团块，发酵12 h后变得较细，这表明REMS被大肠菌群水解，因为从REMS和REMS-CA中释放的葡萄糖在最初2 h内增加。在发酵8 h和12 h后，淀粉残留物变得破碎，产生的物质（葡萄糖）被微生物利用。在24 h时，很难收集REMS和REMS-CA的部分，培养基中的游离葡萄糖几乎被完全利用。

图2 REMS和REMS-CA在发酵过程中的SEM图像

2.2 远距离结构顺序分析

随着发酵时间的延长，RMS的结晶类型没有变化，呈A＋V结晶型。然而，随着发酵的进展，结晶度下降，特别是在4 h内，这表明肠道菌丝主要攻击REM结晶区。体外消化后，EMS和EMSE-CA的结晶度显著降低，即图3A和B中的REMS-0 h和REMS-CA-0 h分别从18.77%降至9.01%和15.11%降至11.90%。REMS和REMS-CA在13.0°、15.1°、16.8°、20.0°和22.5°（2θ）上表现出不同的峰值，这对应于A＋V型晶体结构的特征。在初始发酵过程中，REMS在19.8°、25.0°、28.3°和31.4°（2θ）表现出弱峰；随着发酵的进行，12.8°和19.8°（2θ）的峰变得更强，结晶度呈现脊型变化趋势（0 h-9.01%，4 h-8.59%，8 h14.52%，12 h-1.0.94%）。RE MS-CA的结晶度在12.9°、16.8°、19.8°和22.5°（2θ）出现峰，8 h时在7.2°（2θ）出现峰，4 h时结晶度上升到16.38%，12 h时结晶度下降到9.98%。REMS和REMS-CA在发酵过程中结晶度的变化表明，微生物优先利用淀粉的无定形区，然后攻击淀粉的结晶部分，表现为结晶度的降低。24 h，收集的上层沉积物基本为肠道菌斑，表明EMS和REMSCA的残留物得到了充分利用。虽然本研究中也使用了玉米淀粉，但本研究中消化后的玉米淀粉显示出V型晶体结构，即初始发酵状态的淀粉残渣为A＋V型，而Wang等的研究中初始发酵状态的玉米淀粉为A型，因此发酵过程中淀粉的降解有所不同。

图3 REMS（A）和REMS-CA（B）在体外粪便发酵中的XRD图谱、REMS-CA（C）和12 h粪便发酵中咖啡酸（D）组的咖啡酸分解代谢

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咖啡酸的分解代谢

在12 h时，从发酵培养基的上清液中共鉴定出5 种和7 种咖啡酸代谢物，其中3 种和4 种被定性测定，分别如图3E、F所示。化合物1（RT = 8.37 min）和化合物1′（RT = 7.45 min）分别在m/z 137和259处具有去质子化分子[M − H]−，碎片离子分别在m/z 137、123、107和93以及203、179、153、125和97处。因此，通过与质谱库（Reaxys）和METLIN的比较，化合物1和化合物1′分别被初步鉴定为2-甲氧基-4-甲基苯酚和咖啡酸-3（4）-O-硫酸盐。同样，化合物2和化合物2′在m/z 181处显示出相同的[M − H]−和碎裂模式，在m/z 137、121和109处离子最强，被初步鉴定为二氢咖啡酸，即咖啡酸的氢化产物。化合物3（RT = 20.47 min）和化合物3'（RT = 10.80 min）在m/z 135和207处显示去质子化分子[M − H]−，在m/z 89和177处以及164、147和138处分别存在碎片离子。因此，通过与文献MS光谱数据进行比较，初步确定化合物3和化合物3′为苯乙酸和3,4-二甲氧基反式肉桂酸。化合物4′（RT = 12.14 min ）在m/z 109处显示去质子化分子[M − H]−，在m/z 94 和 78 处出现碎片离子模式。因此，通过与质谱库（Reaxys）进行比较，化合物4′被初步鉴定为邻苯二酚。碳水化合物（REMS-CA）的影响在分解代谢物形成方面有所不同。在没有REMS-CA的情况下，苯乙酸的形成在咖啡酸分解代谢中最高，而在REMS-CA存在的情况下，儿茶酚的含量最高。

表2体外发酵12 h时REMS-CA和咖啡酸基团中咖啡酸的分解代谢

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SCFA产生

表3和表S4显示了所有组发酵过程中SCFAs的浓度和类型以及总SCFAs的产量。不同组SCFAs的水平逐渐增加。由于缺乏碳水化合物和酚酸，空白组的微生物利用蛋白质和脂肪产生SCFAs，乙酸、丙酸和丁酸的水平最低。FOS作为益生元，可以被大肠微生物快速利用并产生SCFAs。在RMS组，SCFAs的积累或产生主要发生在8 h内，表明肠道菌群在早期快速利用RMS产生SCFAs，在后期发酵速率较慢。乙酸是FOS的主要产物，与REMS-CA相当。显然，在REMS中，醋酸盐和丙酸盐的生产发生了转变，特别是在12 h时，这与之前的报告相似，即当淀粉是发酵底物时，醋酸盐是最丰富的微生物副产物。空白组和咖啡酸组之间的显著差异可能归因于缺乏发酵碳水化合物。值得注意的是，咖啡酸组和REMS-CA组表现出最高的丁酸盐浓度，约为FOS的1.5 倍，这表明咖啡酸是一种良好的丁酸盐产生者（表3）。在REMS组（不含CA）和REMS-CA组（含CA）中，CA促进了丁酸的产生，表明配方中的淀粉和咖啡酸的结合可能影响肠道微生物的代谢。在咖啡酸的作用下，REMS-CA可能为丁酸盐的产生创造了有利的环境，从而可能改善肠道健康和代谢功能。此外，单宁酸也被发现可以促进抗性淀粉的发酵产生丁酸盐，这也表明多酚具有促进丁酸盐水平的潜力。

表3在体外粪便发酵期间在不同时间产生的乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐和总SCFA

空白组和咖啡酸组在12 h时的总SCFAs含量分别为（22.34±1.17）、（26.07±0.91） mmol/L，低于FOS在24 h时的（36.98±0.52） mmol/L。FOS在0～2 h期间显示出SCFAs的快速积累。EMS和REMS-CA显示发酵8 h期间SCFA的产生低于FOS；然而，REMS和REMS-CA的SCFA浓度在其余时间内显著增加，REMS-CA呈现出与FOS相似的SCFA产生，而REMS在发酵结束时产生最多的SCFA。根据SEM、XRD和FT-IR结果，微生物暴露并降解了REMS和REMS-CA的离散结构，产生了各种产品，这些产品进一步被用于促进SCFAs的丰度。

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微生物群分析

5.1 微生物多样性分析

Chao 1和ACE指数与社区丰富度呈正相关，Shannon和Simpson指数揭示了不同样本的社区多样性和均匀性。FOS和REMS-CA显示较低的群落多样性，Chao1和ACE的值较低，表明FOS和REMS-CA降低了群落丰富度。进行主坐标分析（PCoA）以比较不同组内的微生物群落。在PCoA图中，样品组成差异的主轴解释值为79.60%，表明REMS和REMS-CA与空白组和咖啡酸组相比具有不同的微生物组成。

5.2 微生物群组成

在门水平上，与空白组相比，咖啡酸、RMS和REMS促进了变形菌门的相对丰度并抑制了厚壁菌门，而FOS和REMS-CA则表现出相反的现象，即厚壁菌门的丰度增加，变形菌门的丰度降低。在碳水化合物组中，拟杆菌的相对丰度显著降低。

图4 24 h体外发酵后，不同组微生物群落组成在门（A）和属（B）水平上的变化及24 h体外发酵结束时培养物中选择性粪便细菌的组成（C、D）、通过LEfSe分析比较各组相对丰度水平的组间差异的LDA得分直方图（E）、通过LEfSe分析不同组之间差异丰度的类群LDA评分树状图（F）

与空白组相比，FOS促进了副梭菌属、链球菌属、双歧杆菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属和未分类的乳杆菌属的增殖，并抑制了大肠埃氏菌属-志贺氏菌属、拟杆菌属、黏液真杆菌属和肠杆菌属的生长（图4C和D）。值得注意的是，EMS组和EMS-CA组显著促进了双歧杆菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属和未分类的乳酸杆菌属的增加，表明REMS和REMS-CA可以作为碳水化合物来源，促进有益菌的生长，对机体健康发挥有益作用。众所周知，双歧杆菌属会产生乙酸盐；与FOS相比，双歧杆菌属的推广可能与REMS发酵产生的更高的乙酸盐产量有关，这与SCFA的变化密切相关。来自水稻淀粉-阿魏酸复合物的抗性淀粉促进了有益微生物群的增殖，如双歧杆菌、瘤胃球菌和毛螺菌属。在动物实验和临床研究中，双歧杆菌在降低血糖、调节胰岛素分泌和改善胰岛素抵抗方面显示出一定的疗效。REMS和REMS-CA中双歧杆菌的相对丰度高于RMS和FOS（P＜0.05），表明两者都起着益生菌的作用，具有调节血糖水平的潜力。需要进一步的研究来证实这些制剂对葡萄糖代谢的影响及其整体治疗潜力。此外，我们还观察到RMS组拟杆菌属的丰度高于REMS和REMS-CA组。咖啡酸组中黏液真杆菌属丰度的增加也可能有助于提高丁酸盐的产量水平。此外，咖啡酸组和REMS组的大肠埃氏菌属-志贺氏菌属的丰度显著高于FOS和REMS-CA组（P＜0.05），这与之前的一项研究报告一致，即莲花RS可以在体外发酵中促进大肠埃氏菌属-志贺氏菌属组的增殖。咖啡酸促进了大肠埃氏菌属-志贺氏菌属的丰度，这可能归因于其对细菌的代谢效用、其改变肠道环境的能力以及其选择性抗菌作用。这一现象可能归因于大肠埃氏菌属-志贺氏菌属可能吸收低分子质量碳源以维持其生长。

如图4E所示，在5组中，属级前20 个微生物群相对丰度较高。在REMS和REMS-CA组中，肠道菌群的调节趋势与FOS组相似。有益细菌的相对丰度，包括双歧杆菌、魏氏杆菌和乳球菌属，以及艾利森杆菌和埃格氏杆菌属的总相对丰度。结果表明，与空白组和咖啡酸组相比，REMS和REMS-CA改变了微生物组成。此外，在没有碳源补充的情况下，咖啡酸还可能通过增加黏液真杆菌属和乳球菌属的丰度来发挥有希望的健康效果。

5.3 粪便微生物群的关键系统型

应用LEfSe多级物种差异鉴别法，进一步分析各组人类粪便微生态群的微生物系统型。线性判别分析得分高于4表明相应组的相对丰度（P＜0.05）高于其他组。在图中5F和G，LEfSe分析结果表明，双歧杆菌科（包括双歧杆杆菌属）在EMS处理组的肠道微生物组中比其他组更为丰富。在REMS-CA中，蓝藻科和魏氏菌属最丰富，而肠杆菌科和大肠杆菌属是咖啡酸组中的优势菌。结果表明，咖啡酸、REMS、REMS-CA和FOS干预后，主导肠道菌群发生了显著变化，菌群组成与碳源和咖啡酸密切相关。最重要的是，玉米淀粉-咖啡酸复合物对消化率和肠道菌群的影响机制可以归纳如下。研究发现，挤压玉米淀粉-咖啡酸复合物不仅表现出更好的餐后血糖延缓特性（低RDS含量和高RS含量），而且未消化的部分立即进入结肠进行糖酵解，产生大量SCFAs，促进有益细菌的增殖，进而调节肠道菌群的健康，咖啡酸可被肠道菌群降解，参与肠道健康调节（图5）。

图5 玉米淀粉-咖啡酸复合物对肠道菌群的残留机理图

Conclusion

在本研究中，我们发现挤压玉米淀粉-咖啡酸复合物的晶体类型为A±V型，咖啡酸降低了长程有序性，同时增加了短程有序性。此外，在添加2.0%（m/m）咖啡酸后，RS水平显著提高。此外，REMS和REMS-CA被大肠微生物群降解，并影响微生物群落。由于碳源的不同，咖啡酸和REMS-CA的代谢存在差异。无论是否添加咖啡酸，REMS和REMS-CA产生的乙酸和丁酸以及总SCFA浓度均高于空白组、咖啡酸组和FOS组。REMS和REMS-CA似乎特别有利于有益菌（如双歧杆菌、乳球菌和未分类乳杆菌属）丰度的显著增加。结果表明，挤压玉米淀粉-咖啡酸具有降低葡萄糖释放和调节肠道健康的潜在能力，可以开发为功能性成分，以改善人体健康。

专家介绍

汪少芸 二级教授/博士生导师

福州大学生物科学与工程学院 院长

福州大学海洋科学与技术研究院 院长

美国威斯康星大学和美国加州大学戴维斯分校博士后，现担任二级教授、博士生导师，福州大学生物科学与工程学院院长，福州大学海洋科学与技术研究院院长。入选全国“三八”红旗手、国家“万人计划”科技创新领军人才、国务院特殊津贴专家、科技部中青年科技创新领军人才、省A类高层次人才、省高层次创新人才、省科技创新领军人才。担任国家“一流专业”负责人、“生物与医药”博士点负责人、省协同创新中心主任、省工程研究中心主任。兼任 《Food Biomacromolecules》主编，《Food Frontiers》副主编，《Food Science of Animal Products》科学主编，《Food Science and Human Wellness》、《Journal of Future Foods》、《食品科学》、《食品工业科技》和《福州大学学报》 （自然科学版）编委，《中外食品技术》首批翻译专家。主持承担省部级以上及横向重大重点项目40余项，编写著作8 部，获授权发明专利79 件，发表SCI/EI收录学术论文230篇，多篇论文获中国食品学会创新科技论文一等奖和福建省自然科学优秀论文一等奖，入选Elsevier全球前2%顶尖科学家榜单。主持成果获国际食品功能因子（ICOFF）学术大会奖、中国轻工业联合会科技进步一等奖、中国石油和化工联合会科技进步一等奖、中国产学研合作创新成果一等奖、中国食品工业协会科技进步一等奖、中国食品产学研优秀科研成果一等奖、福建省科技进步一等奖、福建省自然科学二等奖、福建省科技进步二等奖（排名均第1）；获紫金科技创新奖、厦航奖教金奖；获评宝钢优秀教师、卢嘉锡优秀导师、中国食品科技学会科技创新-杰出青年、省优秀教师、省最美科技特派员、省优秀科技工作者。

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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