专家点评 JEV丨非人灵长类研究发现高表达BDNF小细胞外囊泡显著促进脊髓损伤恢复

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种严重危害人类健康的疾病，可导致损伤平面以下运动、感觉功能障碍，严重时可致截瘫或瘫痪‌。神经元丢失、轴突损伤、断连和脱髓鞘导致功能障碍，而中枢神经系统（CNS）中成年神经元的低再生能力以及局部病变区域有害的微环境是脊髓损伤后修复失败的主要原因。目前，脊髓损伤仍是一个全球性的医学问题，缺乏安全有效的临床治疗方法。

近日，暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院周立兵教授和苏国辉院士团队联合中山大学附属第一医院付清玲教授团队在细胞外囊泡期刊、国际细胞外囊泡学会官方会刊Journal of Extracellular Vesicles上在线发表题为Intranasal delivery of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) loaded small extracellular vesicles for treating acute spinal cord injury in rats and monkeys的研究论文。该研究发现鼻腔递送富含脑源性神经营养因子（BDNF）的间充质干细胞来源小细胞外囊泡/外泌体（MSCs-sEV）能够有效进入脑和脊髓中并靶向富集于脊髓损伤处，对大鼠和猴SCI有显著的治疗效果。

1、成功制备出过表达BDNF的sEV

本研究应用前期建立的永生化MSCs细胞系，应用特有的基因修饰技术制备出过表达BDNF蛋白及mRNA的sEV，并应用大规模制备技术对sEV进行富集纯化。通过纳米追踪、透射电镜和Western blot对sEV特性进行鉴定，并通过ELISA对BDNF-sEV中的BDNF进行精准定量。结果表明，作者成功制备出BDNF-sEV，其可高效表达BDNF的蛋白及mRNA，并且具有良好的稳定性、高纯度，不会损害其形态特征。

2、鼻腔递送的sEV能有效进入大鼠脊髓中并富集于脊髓损伤处

在SCI大鼠中，作者应用mCherry荧光标记的sEV研究了鼻内给药后sEV的生物分布。发现其均匀分布于嗅球和其他脑区，可在大多数神经元以及少量星形胶质细胞和小胶质细胞中观察到。重要的是，在脊髓损伤区域可以观察到富集的mCherry标记的纳米颗粒。作者进一步应用免疫荧光法研究了不同细胞对sEV的摄取情况，结果发现鼻内递送的sEV大部分被神经元摄取，只有少部分被星形胶质细胞和小胶质细胞摄取，表明其对神经元有偏好性。

3、评估BDNF-sEV和sEV在大鼠急性SCI中的治疗效果

动物在SCI后两小时及随后4天每天一次接受BDNF-sEV鼻内给药，作者在损伤后不同时间点进行行为学测试和肌电图测试。结果发现：鼻内递送BDNF-sEV、sEV均能促进SCI大鼠神经功能改善，且BDNF-sEV的效果优于sEV。MRI影像学结果同样显示：鼻内递送BDNF-sEV、sEV均能促进SCI大鼠神经组织修复，且BDNF-sEV的效果优于sEV。

4、鼻腔递送的sEV能有效进入猴脑组织和受损脊髓中并提高脑脊液中BDNF的表达。

由于啮齿类动物脊髓损伤模型和脊髓损伤患者存在较大差异，为了使研究结果更接近于临床，作者随后采用在解剖学、生理学和遗传背景上更接近于人类的食蟹猴建立脊髓损伤模型以进一步评估BDNF-sEV的潜在治疗效果。作者发现：同样，鼻腔递送的sEV能成功进入猴脑组织和受损脊髓中并富集于脊髓损伤处，其中大部分进入神经元中，只有少部分进入星形胶质细胞和小胶质细胞中。此外，鼻内递送BDNF-sEV能提高猴神经组织中BDNF的表达，这可能与其携带或递送的BDNF的mRNA有关。

5、评估BDNF-sEV在猴急性SCI中的治疗效果

作者进一步评估了BDNF-sEV在急性脊髓损伤猴中的治疗效果。脊髓损伤猴接受了7次鼻内给药BDNF-sEV。结果发现:鼻腔递送BDNF-sEV同样能明显促进猴脊髓损伤后运动、感觉及神经传导功能的恢复，并改善了后肢腓肠肌的萎缩情况。

综上，该研究应用永生化MSC及工程化技术成功制备了高表达BDNF蛋白及mRNA的sEV，首次明确了鼻腔递送sEV进入猴神经系统的可能性，并在大鼠和非人灵长类SCI模型中揭示了BDNF-sEV能够发挥sEV和BDNF的双重功效，具有显著促进脊髓损伤后神经功能恢复的治疗效果，极具临床转化应用前景。

暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院博士后黄忠海为本论文的第一作者，暨南大学基础医学院副教授李静和暨南大学附属第一医院骨外科医生沃金博士为本论文的共同第一作者。暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院周立兵教授、苏国辉院士和中山大学附属第一医院付清玲教授为本论文的共同通讯作者。

原文链接：https://isevjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/jev2.70066

专家点评

尹航教授（清华大学）

在本研究中，作者应用工程化技术成功制备了BDNF-sEV，并应用啮齿类及非人灵长类急性脊髓损伤（SCI）模型，证实通过鼻内给药可显著促进脊髓损伤后神经功能恢复。作者发现，鼻内给予荧光标记的sEV可以有效到达大鼠和猴的受损脊髓区域，且主要被神经元摄取。sEV可以减少大鼠急性SCI后胶质细胞反应和促炎细胞因子表达，增强神经元存活和促进血管生成，且促进受损轴突的重新连接，延缓了运动神经元萎缩，并通过BDNF/TrkB信号传导而改善功能。重要的是，本研究进一步应用非人灵长类验证了上述效果，BDNF-sEV可有效抑制急性SCI猴的胶质细胞反应和促炎细胞因子表达，提高脑脊液中的BDNF水平，增强受损脊髓的神经网络重连和功能恢复。

总体而言，本研究应用非人灵长类证实了工程化BDNF-sEV在治疗急性SCI方面具有很大潜力。研究结果令人鼓舞，本研究非常严谨，功能分析做得很好，为SCI的临床治疗提拱了新的潜在治疗靶点。通过基因编辑过表达或递送功能因子产生功能增强型的工程化sEV是EV治疗的重要方向，该研究提供了一种有效的工程化sEV策略。共同通讯作者中山大学附属第一医院付清玲教授连续两届担任国际细胞外囊泡学会亚太大区常委，其长期致力于EV的转化应用研究，这一重要成果也将进一步提升我国学者在EV领域的影响力。

专家点评

郑磊教授（南方医院）

作者研究了加载BDNF的小细胞外囊泡（BDNF-sEV）治疗急性脊髓损伤（SCI）的潜力。作者应用基因编辑技术获得了BDNF-MSC要，并在专利技术基础上大规模制备出BDNF-sEV。应用经鼻给药的方式证实了sEV可分布于中枢神经系统且主要聚集于脊髓损伤区区域，且主要被神经元摄取，通过行为和解剖学评估显示大鼠及非人灵长类动物行为学及和神经功能均有显著改善。机制研究发现BDNF-sEV可激活BDNF-TrkB信号通路、减少神经炎症以及维持神经回路连接。该论文在非人灵长类动物模型中首次观察到通过鼻内递送的sEV在神经系统内的分布，首次提供了体内的重要证据，为鼻内递送sEV在非人灵长类动物模型中的应用提供了新的见解，对开发针对神经系统疾病的sEV相关治疗方法具有重要意义。总之，该研究应用猴子模型全面系统地证明了BDNF-sEV对SCI功能恢复的作用，数据可靠。这一研究受到国家重点研发计划的资助，该项目由共同通讯作者中山大学附属第一医院付清玲教授为首席科学家，暨南大学周立兵教授和我院研究团队等共同参与，以干细胞sEV临床转化应用为核心开展基础机制研究和临床研究，已取得多项进展，且正在开展多项有关干细胞sEV在神经系统疾病如脑卒中、渐冻症、神经退行性疾病中的研究者发起的临床研究，本研究是该项目的又一重要成果。

制版人：十一

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