思路打开！单细胞数据分析竟然可以这么玩？！拟时序+互作分析揭示免疫动态图谱！！

肺腺癌（LUAD）是全球致死率最高的癌症之一，而肿瘤微环境中的免疫细胞如何影响癌症进展，一直是科学家探索的焦点。2024年3月发表在 cell reports medicine 上标题为An immune cell map of human lung adenocarcinoma development reveals an anti-tumoral role of the Tfhdependent tertiary lymphoid structure。中国科研团队通过单细胞测序技术，首次绘制肺腺癌从早期到晚期的免疫细胞动态图谱，解构三级淋巴结构（TLS）——它由 Tfh 细胞、B 细胞和功能失调的CD8+ T 细胞组成，竟能显著抑制肿瘤生长，甚至与患者生存率直接挂钩！

更惊人的是，破坏这种结构的小鼠肿瘤疯狂生长，而激活其核心信号通路（IL-21）则可能成为未来治疗的新靶点。这不仅是癌症免疫研究的里程碑，更为千万患者点亮了希望之光！为什么这种结构能“逆天改命”？它如何从无到有形成抗癌防线？答案藏在肿瘤与免疫细胞的「对话」中……

实验方法及结果：

图1：肺腺癌（LUAD）发展过程中免疫细胞的单细胞转录组图谱

实验方法：对34例正常肺组织、4例原位腺癌（AIS）、22例微浸润腺癌（MIA）和33例浸润性腺癌（IAC）样本进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。通过欧几里得距离分析比较不同阶段样本的免疫微环境差异。结果：正常肺与肿瘤样本的免疫细胞组成存在显著差异，且随着肿瘤进展（从AIS到IAC），免疫微环境的异质性逐渐增加：提示肿瘤侵袭导致免疫细胞动态显著改变。

图2：LUAD进展中免疫细胞组成的动态变化

实验方法：通过流式细胞术（FACS）验证不同阶段免疫细胞的比例变化。计算细胞毒性基因（如GZMB）和抑制性受体基因（如PDCD1）的活性评分。对CD8+ T细胞进行轨迹分析，探究其分化状态。结果：CD4+ T细胞和B细胞在IAC阶段显著增加，而NK细胞和单核细胞减少。CD8+ T细胞的功能状态逐渐从细胞毒性（CTL）向功能失调（高表达CXCL13）转变。功能失调的CD8+ T细胞和Tfh样细胞通过局部增殖和克隆扩增增加。

图3：B细胞在肿瘤内的增殖与分化

实验方法：多色免疫荧光染色（CD19、CD4、CD8）观察B细胞和T细胞的空间分布。对B细胞亚型（如GC B细胞、记忆B细胞）进行scRNA-seq亚群分析。结合TCGA数据库验证B细胞亚型的表达特征。结果：B细胞在IAC阶段形成聚集结构，且主要亚型为GC B细胞和CD27+记忆B细胞。肿瘤内的B细胞通过局部增殖（Ki67+）和分化（从GC B细胞到浆细胞）增加。TCGA数据中，高表达CD27和CD83的活化记忆B细胞与IAC阶段显著相关。

图4：Tfh样细胞与B细胞的相互作用及TLS形成

实验方法：基因共表达分析（如CXCL13-CXCR5、IL-21-IL-21R）验证Tfh样细胞与B细胞的相互作用。免疫荧光染色（CD20、CD4、CXCL13）观察TLS的结构。利用TCGA数据分析TLS相关基因表达与患者预后的关联。结果：Tfh样细胞高表达CXCL13和IL-21，与GCB细胞共定位形成TLS。TLS内含CD21+滤泡树突状细胞和PNAd+高内皮小静脉，结构类似次级淋巴器官。高TLS评分的患者生存率显著优于低评分患者（p<0.05）。

图5：TLS在肿瘤发展中的动态形成过程

实验方法：多色免疫荧光染色（CD4、CD20、CD21）分析不同阶段肿瘤的TLS结构。定量计算TLS密度及面积占比。结果：TLS形成分为三个阶段：IAC阶段的mTLS比例显著高于AIS和MIA（p<0.01）。

图6：TLS的临床意义及功能验证

实验方法：利用TCGA数据对TLS相关基因进行生存分析。构建小鼠模型（KPC肺癌模型、CD4CRE;Bcl6fl/fl小鼠）验证Tfh和B细胞的功能。用抗IL-21R抗体阻断IL-21信号通路。结果：高表达Tfh样细胞或GC B细胞基因特征的患者总生存期更长（p<0.05）。Tfh或B细胞缺失的小鼠肿瘤生长加速，TLS数量减少。阻断IL-21R信号后，TLS的形成和抗肿瘤效应被抑制，证实IL-21-IL-21R是TLS功能的关键通路。

本文通过单细胞测序构建了LUAD发展中的免疫动态图谱，结合多色免疫荧光和空间分析揭示TLS的形成过程，利用TCGA数据和小鼠模型验证了TLS的临床意义与功能机制。实验设计覆盖从分子机制到临床预后的多层次验证，值得借鉴。