Cancer Cell｜CRISPR筛选揭示ZEB2作为TAMs抗肿瘤或促肿瘤活性的关键分子

撰文 | 风

巨噬细胞是维持组织稳态的高度可塑性免疫细胞【1,2】。在肿瘤微环境中，细胞因子和缺氧等环境压力因子诱导一种特殊类型的组织巨噬细胞-肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages，TAMs）。一般来讲，TAMs通过免疫抑制、血管生成和组织 重塑等方式促进肿瘤生长（详见BioArt报道：；；；）。但是，也存在一群特殊的TAMs改善肿瘤患者生存率和抗肿瘤治疗敏感性（详见BioArt报道：；）。迄今为止，针对TAMs的临床试验，无论是单一治疗还是联合治疗，对实体肿瘤的疗效都有限。这些靶向TAMs的治疗障碍来源于对TAMs的调节缺乏足够的理解和认识。经典的M1巨噬细胞（抗肿瘤）和M2巨噬细胞（促肿瘤）分类过于简化，并不能准确反应真实情况和预测临床结局【3】。因此，促进TAMs的基本认知和开发有效的TAMs靶向治疗策略需要深层理解控制TAMs功能的分子环路，使其能够有效地从亲肿瘤细胞重编程为抗肿瘤细胞。

近日，Cancer Cell杂志在线发表以色列魏茨曼科学研究所系统免疫学系Ido Amit团队题为ZEB2 is a master switch controlling the tumor-associated macrophage program的研究文章。该文章通过整合scRNA-seq和CRISPR筛选揭示ZEB2是调控TAMs促进/抑制肿瘤功能行为的关键分子开关，为靶向TAMs开发抗肿瘤干预方法提供新的靶点。

首先，作者在公共数据库对人来源不同肿瘤组织的scRNA-seq数据再次分析，发现5种TAMs。Hotspot分析则鉴定9种不同的基因表达模式。其中，模式1富集补体和抗原提成相关基因；模块4与吞噬有关；模块6与免疫抑制有关；模块8与血管生成有关；模块3与干扰素反应有关。值得注意的是，模块1、2、5和7在健康组织驻留性巨噬细胞中特异富集，而模块3、4、6、和8则富集在TAMs中。随后，作者使用类似的方法分析小鼠肿瘤组织来源的scRNA-seq数据，并将其与人源数据对比，发现人和小鼠73.2%的TAMs相关基因表达模式高度保守，提示TAMs存在保守的基因调节程序。

紧接着，作者在CRISPR-Cas9敲入小鼠来源巨噬细胞联合文库筛选以及TAMs体外分化（IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β和IFN-γ）后行scRNA-seq分析试图揭示TAMs的调控机制。深度生成模型MrVI解析每一个遗传扰动如何调控巨噬细胞或者TAMs功能相关的基因表达。首先，作者发现Ythdf1、Ythdf2、Stat6和Zeb2等基因的敲除造成显著的扰动效应。随后，作者通过基因网络分析揭示遗传扰动引起不同基因表达模式改变的相似性，发现7群不同的基因表达反应。再次结合Hotspot分析，作者将这些基因表达反应关联至10个不同的功能基因模式，例如补体激活在Stat6和Zeb2等扰乱后富集提示基因负调控巨噬细胞补体激活；而Ythdf1、Ythdf2、Stat6和Zeb2等扰动促进I型IFN反应提示靶向这些基因提高抗肿瘤效应。总之，作者的数据分析提供了一个功能性TAMs调节网络以指导TAMs检查点的合理设计或治疗组合来选择性地干扰巨噬细胞表型的特定基因程序。

作者在上述分析中发现Zeb2扰动具有最明显的抗肿瘤潜力。另外，使用上述分析方法在最近报道的另一项人源TAMs数据中证实Zeb2是排名靠前的靶点（4）。因此，作者推测Zeb2是影响巨噬细胞促肿瘤和抗肿瘤的主要靶点。随后，作者使用一系列实验验证这种猜测。首先，Zeb2敲除促进共刺激分子和抗原提呈（MHCII和CD86）相关基因的表达并降低免疫抑制分子（CD204）的表达。其次，共培养实验证实Zeb2敲除显著削弱TAMs对T细胞的抑制能力，表现为CD4/CD8 T细胞增殖和效应分子表达的增加。另外，Zeb2敲除降低TAMs的吞噬作用。作者在一篇巨噬细胞特异性Zeb2敲除小鼠单细胞测序数据分析中也发现Zeb2抑制巨噬细胞抗原提呈、补体激活和IFN并促进免疫抑制（5）。这些数据表明ZEB2作为主要的TAMs重编程检查点调节促肿瘤活性。

机制上，ATAC-seq分析表明Zeb2敲除显著改变TAMs的染色质开放图谱。具体来说，Zeb2敲除使得IFN反应、抗原提呈和补体激活等抗肿瘤相关基因的增强子区域从关闭转换为开放状态。转录因子分析表明Zeb2敲除促进Stat1、Nfkb和Irf1/4等炎性转录因子而抑制Stat6、Bach1和AP-1等转录因子的富集。有意思得是，Zeb2敲除增强Zeb1在抗肿瘤基因的富集。值得注意都是，作者发现Zeb2基因附近存在Stat6结合位点，表明Zeb2可能是IL-4/STAT6的下游共同促进TAMs的促肿瘤作用。这些数据表明Zeb2是TAMs表观图谱的主要重塑因子。

最后，作者通过TCGA数据库分析表明巨噬细胞而不是肿瘤细胞的Zeb2表达水平与肺鳞癌和膀胱癌预后强相关。随后，作者使用Zeb2 siRNA抗原提呈细胞选择性递送（CpG-siRNAZeb2）系统瘤内注射在结肠癌和膀胱癌以及肺癌中均发现Zeb2在TAMs敲减显著抑制肿瘤的发展，同时没有瘤内注射的肿瘤也被抑制，表明存在远隔效应。肿瘤内免疫细胞scRNA-seq分析表明CpG-siRNAZeb2应用促进肿瘤TAMs细胞IFN反应和抗原提呈并抑制促肿瘤相关基因表达模式。与此同时，CpG-siRNAZeb2显著增强CD8 T细胞活化和效应功能并减少Treg的浸润。另外，NK细胞杀伤相关分子表达也在CpG-siRNAZeb2应用组增强。作者也在另一种系统性甘露糖基化脂质纳米颗粒-siRNAZeb2给药方式同样证实Zeb2敲减的抗肿瘤效应。这些数据表明Zeb2在TAMs中敲减可以在富含巨噬细胞的肿瘤中实现良好的治疗效果。

综上所述，这项研究揭示通过CRISPR筛选鉴定Zeb2作为影响TAMs抗肿瘤和促肿瘤效应的关键调控因子，并强调靶向巨噬细胞Zeb2可以作为肿瘤治疗的有效策略，为TAMs的调节机制以及开发肿瘤治疗手段提供新的理解和靶点。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.03.021

制版人： 十一

参考文献

1. Gajanan, Katkar., Pradipta, Ghosh.(2023). Macrophage states: there's a method in the madness.Trends Immunol,44(12), 0. doi:10.1016/j.it.2023.10.006

2. Thomas A, Wynn., Ajay, Chawla., Jeffrey W, Pollard.(2013). Macrophage biology in development, homeostasis and disease.Nature, 496(7446), 0. doi:10.1038/nature12034

3. C D, Mills., K, Kincaid., J M, Alt., M J, Heilman., A M, Hill.(2000). M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm.J Immunol,164(12), 0. doi:10.4049/jimmunol.164.12.6166

4. Ruben, Bill., Pratyaksha, Wirapati., Marius, Messemaker., Whijae, Roh., Beatrice, Zitti., Florent, et al.(2023). CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers.Science, 381(6657), 0. doi:10.1126/science.ade2292

5. Charlotte L, Scott., Wouter, T'Jonck., Liesbet, Martens., Helena, Todorov., Dorine, Sichien., et al.(2018). The Transcription Factor ZEB2 Is Required to Maintain the Tissue-Specific Identities of Macrophages.Immunity, 49(2), 0. doi:10.1016/j.immuni.2018.07.004

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