重磅！空军军医大学张芳琳/叶伟团队近期在汉坦病毒及抗体检测方法的开发及应用取得系列研究进展

世界范围内，汉坦病毒引起两种严重疾病：肾综合征出血热（HFRS）和在汉坦病毒心肺综合征（HCPS），分别流行于欧亚大陆和美洲大陆，病死率分别高达15%和40%，严重威胁全球公共卫生安全。2024年世界卫生组织（WHO）将汉坦病毒首次列为国际关注的突发公共卫生事件（Public Health Emergencies of International Concern，PHEIC）的高风险病原体，呼吁加强其基础和应用基础研究。我国是全球HFRS发病人数最多的国家，年发病人数占世界90%以上，主要流行汉滩病毒（HTNV）和汉城病毒（SEOV）两种型别，其中HTNV引起的HFRS症状更重、病死率更高。

HTNV在细胞内复制缓慢，几乎不产生致细胞病变效应，因此其滴度检测主要依赖酶联免疫吸附法（ELISA）显色检测病毒半数组织感染量（TCID50），但该方法操作复杂，耗时长（10天及以上）。为解决上述难题，近年来研究团队针对HTNV检测滴定方法，尤其是血清学检测技术的开发及应用取得了一系列原创性研究工作，相关成果发表在Virology. 2025 April 17; 608:110542. Front Pharmacol. 2019 Oct 16; 10:1203；NPJ Vaccines. 2024 Feb 10;9(1):28；Virol J. 2025 Feb 8;22(1):31；Free Radical Biol Med. 2024 Nov 1: 224: 232-245。

1、基于酶联焦点形成试验（FFA）检测HTNV复制的方法学建立及应用

HTNV在细胞内复制时产生的细胞病变效应较小，经改进抗原检测方法——酶联免疫吸附测定（ELISA），虽然易操作，但仍耗时较长，一般需要10天。基于上述问题，研究团队建立了基于酶联焦点形成试验（Focus formation assay，FFA）检测HTNV滴度的方法，通过不同条件比较，发现5天（5 dpi）即可检测到明显的斑点，与传统ELISA法相比，该检测滴定结果更准确，且时间缩短了一半。

同时，利用该方法评估了法匹拉韦（T-705）和玛巴洛沙韦酸（BXA）两种抗病毒药物对HTNV复制的影响。综上所述，团队建立了快速、准确的HTNV滴度测定方法，并基于此建立了中和抗体效价检测方法（Focus reduction neutralizing test，FRNT）【Front Pharmacol. 2019 Oct 16; 10:1203】。

后续团队对该方法进行进一步的改良，现可直接在96孔板上进行高通量的病毒滴度和中和抗体水平检测，有力促进了团队相关工作的开展。

Disparate macrophage responses are linked to infection outcome of Hantan virus in humans or rodents. Naturecommunication.

25-Hydroxycholesterol inhibits Hantavirus infection by reprogramming cholesterol metabolism.

2、基于qRT-PCR检测汉滩病毒中和抗体方法的建立及应用

HTNV引起的重症HFRS目前缺乏特效治疗手段，抗血清或中和抗体（NAb）能够阻断病毒感染。上述基于FRNT的中和抗体效价测定方法虽然准确，但需7天左右完成。团队基于实时定量RT-PCR技术将HTNV NAb中和效价测定时间缩短1至2天。通过对比病毒RNA拷贝数标准曲线，以及胞内HTNV与分泌性HTNV的增殖动力学特征，确定了基于qRT-PCR的病毒RNA拷贝数检测的最适时间窗口。

利用该方法测定HFRS恢复期血清样本的中和效价时，可在1至2天内获得结果。且该法与基于FRNT的“金标准”具有良好的相关性。综上所述，本研究建立了一种可快速测定汉坦病毒中和抗体水平的病毒RNA转录本拷贝数减少中和试验（VcRNT），为确定患者血清汉坦病毒中和抗体水平提供了替代FRNT的快速检测方案【Virology. 2025 April 17; 608:110542.】。

3、表达汉坦病毒包膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒（rVSV-HTNV-GP）的构建及应用

水泡性口炎病毒（VSV）是一种单负链不分节段的RNA病毒，属弹状病毒科水泡病毒属。VSV基因组含有5个开放阅读框（ORF），分别编码核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和RdRp（L）。VSV由于对人类的致病性极低和其基因组较稳定，使得反向遗传学操作简便。团队前期利用序列优化的HTNV GP替换VSV-G成功拯救了携带报告基因绿色荧光蛋白并表达HTNV GP的重组病毒——rVSV-HTNV-GP。

利用该重组病毒，团队建立了绿色荧光灶减少中和实验（GFP-based foci-reduction neutralization test，GRNT），并基于该实验评估了HFRS恢复期血浆对HTNV和rVSV-HTNV-GP的中和效果。结果发现虽然血清中和滴度中和rVSV-HTNV-GP效果要显著高于HTNV（2到10倍），但两者之间的中和活性具有显著的相关性，因该方法仅需7h即可完成感染，因此可以快速进行中和抗体效价的初步判定【NPJ Vaccines. 2024 Feb 10;9(1):28.】。

4、基于rVSV-HTNV-GP检测汉滩病毒中和抗体方法的标准化、验证和比较评价

团队建立的基于rVSV-HTNV-GP的GRNT中和方法需要高内涵成像仪进行检测，限制了其应用前景。因此，团队在此基础上，利用rVSV-HTNV-GP建立了空斑减少中和试验（Plaque reduction neutralisation test，PRNT）方法。与金标准FRNT相比，PRNT操作程序更简单，不依赖于针对HTNV NP特异性的抗体，且实验时间更短，仅需4天左右【Virol J. 2025 Feb 8;22(1):31】。

团队利用该方法检测了47份来自HFRS患者、健康供体和灭活疫苗接种者的血清样本的中和抗体水平。结果表明PRNT与FRNT的中和抗体滴度相关性良好，表明基于 rVSV-HTNV-GP的PRNT也可用作快速检测汉坦病毒中和抗体效价的替代工具。

并且多次重复PRNT方法内部相关系数（ICC）接近1.0，表明该法具有很好的重复性。